鱼皮中胶原蛋白的提取.doc

曲 靖 师 范 学 院本科毕业论文论文题目: 鱼皮中胶原蛋白的提取作 者： 卢鹏洋 学号： 2013163111 院 系：生物资源与食品科学学院年级： 2013级 学 科： 工学 专业：食品科学与工程 指导教师： 景年华 职称: 助教 完成时间: 2016年1月 曲靖师范学院生物资源与食品科学学院 曲靖师范学院 本论文（设计）经答辩小组全体成员审查，确认符合曲靖师范学院本科(学士学位)毕业论文（设计）质量要求。答辩小组签名：主席姓 名工 作 单 位职 称成员 答辩日期：原创性声明本人声明：所呈交的论文（设计）是本人在指导教师指导下进行的研究工作成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已发表或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所作的任何贡献已在论文（设计）中作了明确的说明并表示了谢意。签名： 日期： 。论文（设计）使用授权说明本论文（设计）作者完全了解曲靖师范学院有关保留、使用毕业(学位)论文（设计）的规定，即学校有权保留论文（设计）及送交论文（设计）复印件，允许论文（设计）被查阅和借阅；学校可以公布论文（设计）的全部或部分内容。签名： 指导教师签名： 日期： 。鱼皮中胶原蛋白的提取摘要 胶原蛋白是构成动物支持组织的结构蛋白质,其提取制品已广泛应用于医药、保健、食品加工、化妆品等众多领域,迄今其制品主要是从一些陆生哺乳动物如牛、鱼等的皮肤提取。但近年来，科学家对鱼皮中胶原蛋白的提取也没有止步，“鱼皮”含有丰富的蛋白质和多种微量元素，其蛋白质主要是大分子的胶原蛋白及粘多糖的成分，是女士养颜护肤美容保健佳品，也是滋补佳品。提取方法主要有聚能式脉冲逆流超声辅助法、中性盐萃取法、酶法、酸法、碱法，而这些方法都尚未获得较高的提取率，但其中酶法提取对胶原蛋白破坏性小，能更好、更完全地得到活性胶原蛋白，具有反应速度快、时间短、无环境污染等优点。超声波提取因其空穴效应、污染小、节能、环保等优越性能在当今的生产、生活和科学研究中被广泛使用。所以本论文以新鲜鲫鱼皮为原料，以胶原蛋白提取率为目标参数，采用超声波提取法对鱼皮中胶原蛋白提取，从而进一步提高鱼皮的药用、食用价值。选取提取时间、料液比、提取功率3个影响因子进行单因素实验。在单因素实验设计的基础上利用正交试验，得鱼皮中胶原蛋白提取的最佳工艺条件。结果表明，当提取时间为55min、料液比为1:45、提取功率为100%时候提取率最高为关键字：鲫鱼皮；超声波提取法；胶原蛋白；正交试验Optimization Of Extraction of collagen from skinAbstract : Protein collagen is animal support organization structure, its products have been widely used in medicine, health care, food processing, cosmetics and many other fields, so far its products mainly from terrestrial mammals such as cows, pigs and other skin extract. But in recent years, scientists on the extraction of collagen from skin did not stop, skin is rich in proteins and other trace elements, proteins are large molecules of collagen and glycosaminoglycan constituents, it is beauty skin care and beauty-care to share, and tonic. Extraction methods have shaped Pulse counter ultrasound-assisted, neutral salt extraction, enzymatic method, acid, alkali, all of which have not been high extraction rate, but less damaging enzymatic extraction of collagen protein, can provide better, more fully active collagen, high response speed, time is short, no environmental pollution and so on. Ultrasonic wave extraction from the hole effect, pollution, energy saving, environmental protection and other advantages in todays production and daily life and is widely used in scientific research. Fresh fish as raw material this thesis, aimed at collagen extraction rate parameters, extracted by ultrasonic wave extraction of collagen in the skin, so as to further enhance the value of medicinal, edible skin. Select time, solid-liquid ratio, extraction power 3 factors of single factors. Single factors based on orthogonal test design, optimum conditions of extracting of collagen in the skin. Results show that, when the time is 55min, solid-liquid ratio is 1:45, the power is 100% when the extraction rates of up toKey words : CARP skins, ultrasonic extraction of collagen protein; by orthogonal test目录1 引言11.1 鱼皮简介11.2 胶原蛋白简介11.3 超声波萃取技术21.4 本论文选题意义及研究内容22 材料与方法32.1 材料与试剂32.2 主要仪器与设备42.3 方法42.3.1鱼皮胶原蛋白的提取42.3.2 胶原蛋白提取率的计算42.3.3 单因素实验设计42.3.4 正交试验设计53 结果与分析53.1 单因素试验53.1.1 超声功率对样品胶原蛋白提取的影响53.1.2 提取时间对样品胶原蛋白提取的影响63.1.3 料液比对样品胶原蛋白提取的影响73.2 正交设计试验84 结论9 参考文献11 致谢12生物资源与食品科学学院2017届本科毕业论文1 引言1.1 鱼皮简介 中国是世界上最大的淡水鱼养殖 3 ，根据中国2007的淡水鱼生产1971万吨统计，主要品种有青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼。随着鱼类加工业的发展，在生产过程中产生大量的废弃物，包括皮、鳞和鱼骨，50%70%（占总鱼重量的4）。通常这些低水平的加工和利用的废物，只有一小部分被加工成饲料和肥料，大部分是简单的丢弃，它不仅会污染环境，并造成资源浪费。据介绍，富含胶原蛋白的皮肤、鱼骨和鳞片 3 ，尤其是鱼类，其中胶原蛋白含量高达80%以上，许多高于身体其他部位 5 ，鱼皮胶原蛋白的提取不仅能够充分利用资源，增加鱼加工的附加值，减少环境污染，是促进鱼类加工业发展的重要。 1.2 胶原蛋白简介胶原蛋白是哺乳动物体内含量最为丰富的动物蛋白，也是细胞外基质的结构蛋白质,其结构由3条链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构,即超螺旋结构11。胶原蛋白可作为细胞、组织乃至器官正常功能的支持, 对创伤修复具有重要的作用。此外, 胶原蛋白还具有抗衰老、美容、增强体质等功效 12。近年来, 胶原蛋白已被广泛应用于食品、医药、美容、保健品等行业 13。在食品领域,但需要注意的是，胶原蛋白不能通过直接食用动物的皮或肉所得到，必须经过加工处理，才能够更大程度的实现其价值。 在食品加工中, 应用精制活性胶原蛋白和高浓缩胶原蛋白质模拟食品, 口服给人体直接吸收，另外，胶原蛋白还可作为食品添加剂、饮料澄清剂、食品包装材料等应用于食品中14-17；在医药方面，胶原蛋白以其天然的低毒性、低抗原性、低免疫性、能抑制上皮组织细胞的迁移、能引导细胞再生和与人体相容性好等优点10，而广泛应用于生物医学材料和临床医疗11-14。在美容、保健领域，由于胶原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18种氨基酸,可用作优质化妆品的新型原料及近代医学美容中皮肤组织理想的填充物15-18, 胶原蛋白具有输送钙并结合在骨骼中沉淀起到增加骨量，增强骨密度的明显作用，不仅能增强和维持肌肤良好的弹性,强化肌肤的韧性,延缓肌体的衰老,同时还可强筋健骨,增强体质19-20。从根本上来说，胶原蛋白的来源来自于动物的皮骨中，但由于现阶段群体养殖，卫生方面服务不到位，导致出现的各种各样得在动物间传播的疾病。例如禽流感-H7N9，疯牛病等等，同时由于各地信奉的宗教不同，例如我国回族不吃猪肉，印度人不吃牛肉等，导致这种来源广阔，快捷的动物提取胶原蛋白很难真正意义的进入市场,因此作为猪、牛的替代原料，“鱼”这个人们都爱的食品逐渐的在胶原蛋白提取这个行业的重要性越来越突出，人们吃鱼不仅能促进身体发育，还能有效的降低胆固醇。因此深入开展胶原蛋白研究，对发展和创制新药及功能性保健食品，以及对资源的合理开发利用和环境的保护都具有重要学术意义和直接或潜在的社会经济价值。1.3 超声波萃取技术穿透能力强，能够更好、更便捷的获得声能一直是超声波优于其他提取技术的特点。当涉及到超声波在介质中的传播时, 由于超声波与介质之间的相互作用, 介质中的物理化学变化, 其结果是机械效应、空化效应、热效应、4种超声波作用的化学作用。高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。其中对超声波辅助提取起作用的是机械效应和空化作用。超声波辅助萃取可大大促进溶剂提取天然成分的过程。传统的提取方法是为了提取原材料中的某种成分，选取相对应的溶剂，同时加上多层级的辅助方法搅拌，加热等。超声波的空化效应、高频振动效应和混和效应，形成膨胀和压缩的全过程，在空化场的作用下，在萃取溶剂中，因为膨胀从而形成负压，如果在实验条件允许的情况下尽可能的加大超声功率，膨胀的整个过程就会在溶液中生成气泡或将溶液击碎成很多很小的的小孔。这些小孔立马就会自行密封，在密封过程时产生高达3000MPa的瞬间压力，达到提取内容物的目的21。经过反复阅读大量文献，超声波的强烈、振动、空化作用再辅以搅拌可以有效破坏细胞结构，加速有效物质的溶出，不仅可以提高提取效率，而且可以大大缩短时间，节省能源。目前，超声波提取胶原蛋白研究中，杨萌萌22等人在用超声波提取牛蹄筋胶原蛋白取得较为严谨和好的成果。近年来很多科研工作者在皮胶原蛋白提取工艺方面进行了研究，。刁雪洋24分别采用振荡、微波、超高压和超声波几种辅助提取方法对胶原蛋白进行提取，为鱼皮的开发利用奠定了基础。1.4 本论文选题意义及研究内容近年来，随着生物化学、分子生物化学和细胞生物化学的不断发展，人们对胶原蛋白的认识不断深入。特别是20世纪末“绿色化学”概念的提出，使得利用天然生物质资源，采用环境友好的技术，开发高附加值的环境友好型产品意义更为重大。胶原蛋白作为优质天然高分子的应用也必将越来越广泛。但由于其高昂的价格(特别是特殊类型的胶原蛋白的价格)难以让人们普遍接受，应用超声辅助提取手段,在不影响其生物活性的条件下，提高其产量,进行工业化应用，对降低产品的成本有积极的意义。因此本论文采用超声提取对鱼皮胶原蛋白的提取工艺, 有一定的学术价值和应用价值。选题的意义和价值体现在以下三方面：（1）鱼皮胶原蛋白的特性 目前已经确认的胶原蛋白有27种类型，其中型胶原蛋白在动物体内含量最多应用也最广泛，主要存在于动物的真皮中6。现阶段人们大多从深海鱼鱼皮中提取胶原蛋白，由于深海的低温低压，使这类胶原蛋白具有着普通的陆生动物胶原蛋白和淡水鱼、浅海鱼胶原蛋白所不具备的特殊性质。对于水产养殖只是少量胶原和胶原类型, 被发现的鱼类广泛分布在软骨和脊髓型和型和真皮的肌肉, 类型骨骼, 鳞片, 膀胱, 肌肉等。皮肤的主要成分是纤维状胶原蛋白, 最高的蛋白质含量可以占总价值的 80%, 除了少量的弹性蛋白、白蛋白、球蛋白和粘液 8。（2）鱼皮胶原蛋白的价值 相对于从陆生动物中提取的胶原蛋白，鱼皮中提取的在美容和抗衰老方面更优。由于鱼类属于变温动物，因此鱼皮胶原蛋白与哺乳动物皮胶原蛋白相比，首先得区别在于胶原蛋白活性激发温度，从陆生动物中提取的胶原蛋白要在35度以上才能完全激发胶原蛋白活性，而鱼的胶原蛋白活性激活温度就要低的多，只需要适度就可以，如果要进行美容，外敷的话，鱼皮胶原蛋白是最好的选择，在直接食用方面，鱼皮胶原蛋白的胶原纤维束更粗。2 材料与方法2.1 材料与试剂新鲜鲫鱼（曲靖沃尔玛超市）、乙酸（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、氯化钠（天津市鼎盛鑫化工有限公司）、盐酸（福州痕量分析生物科技有限公司）、透析袋（南京乐进生物实验器材商城）。2.2 主要仪器与设备DK-8AB电热恒温水浴锅（上海-恒科学仪器有限公司）、CP214电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）、DHG9123型恒温烘箱（上海精密科学仪器有限公司）、80-2台式低速离心机(上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂)、SK3200LHC超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)，其他为实验室常用仪器设备。2.3 方法2.3.1 鱼皮胶原蛋白的提取（1）试验材料预处理：将新鲜鲫鱼剥皮去污，然后用刀剔去皮下脂肪。将剔脂后的鱼皮切成0.53cm或13cm不等的皮条，精密称取2.000g，清洁两次。脱脂时，将皮条放在烧杯中, 用4-5倍40温水洗净，按上述方法重复一次，再用Nacl溶液进行浸泡（料液比1:100）6小时后用清水漂洗两次，再用NaOH溶液进行浸泡（料液比1:100）6小时后用清水漂洗两次，将脱脂后的鱼皮置于0.5moL/L乙酸中（料液比1:50，w/v），浸泡12h后放入冰箱待用。(2）胶原蛋白的提取：按预定参数超声处理，用乙酸为溶液，放入鱼皮，再放入容量瓶中进行超声。用纱布过滤得滤液；取上述滤液，加入NaCl进行盐析，使NaCI最终浓度不超过2mol/L；盐析后的溶液于4下沉降12h，离心(10000r/m in)30min，弃去上清液，沉淀转入透析袋中透析，蒸馏水为透析外液，期间每30min换一次透析液，直到用10的AgNO3溶液检查透析外液无白色沉淀为止，透析结束将透析袋内液倒入干净的培养皿中，普通干燥法干燥得胶原蛋白。2.3.2 胶原蛋白提取率的计算公式中：G为干燥后胶原蛋白质量，g；G0为鱼皮质量，g。2.3.3 单因素实验设计选取超声功率、提取时间、料液比3个可能影响胶原蛋白提取效率的因素，以胶原蛋白提取率为考察指标，进行单因素试验。（1）超声功率对样品鱼皮胶原蛋白提取的影响：精密称取样品2.000g，经上述预处理后，在室温下料液比为（1:25）的情况下分别，以60%、70%、80%、90%、100%超声功率提取35min，测定其胶原蛋白的提取率。（2）乙酸与鱼皮比对鱼皮胶原蛋白提取的影响：精密称取样品2.000g，经上述预处理后，在室温下以100%超声功率提取35min，用料液比为1:15，1:25，1:35,1:45，1:55测定其胶原蛋白的提取率。（3) 提取时间对样品鱼皮胶原蛋白提取的影响：精密称取样品2.000g，经上述预处理后，在室温下，以100%超声功率，料液比1:25提取15min，25min，35min，45min，55min,测定其胶原蛋白的提取率。2.3.4 正交试验设计根据超提取的单因素试验结果，以提取率为目标参数，分别对超声功率A、提取时间B、料液比C3因素进行正交试验。试验因素与编码水平设计见表1。表1 鱼皮胶原蛋白提取正交试验设计因素水平及编码Tab.1 The level and coding of carp skin collagen extraction orthogonal experimental design factor编码变量水平超声功率（A,%）提取时间（B,min）料液比（C,g/ml）160251：15270351：25380451：35490551：455100651：553 结果与分析3.1 单因素试验3.1.1 超声功率对样品胶原蛋白提取的影响不同超声功率对鱼皮胶原蛋白提取效率的影响见图1。由图1可知，在料液比（乙酸：鱼皮=1:25）提取时间为35min情况下，随着超声功率的增大，鱼皮胶原蛋白提取率增加，当超声功率为60%-70%时，胶原蛋白提取率增加较缓慢，提取率在8%-12%之间；当超声功率超过80%时，胶原蛋白提取率增加较快，提取率为16%；当超声功率达到100时，胶原蛋白提取率最大，此时提取率为25%。以上实验表明在乙酸作为萃取剂的情况下，超声功率越大，超声波越容易破坏细胞结构，加速有效物质的溶出，这样不仅可以提高提取效率，而且可以大大缩短时间，节省能源，因此选择超声功率为100比较合适。 图1 超声功率对样品胶原蛋白提取的影响Figure 1 The effect of different ultrasonic power on the extraction of collagen in the sample3.1.2 提取时间对样品胶原蛋白提取的影响提取时间对鱼皮胶原蛋白提取效率的影响见图2。由图2可知，在超声波处理（超声功率为100），料液比1:25情况下，随着提取时间的增加，胶原蛋白的提取率呈现先升高后降低的趋势，提取率范围为0%-24.5% ，并且提取时间达到55min时，提取率达到最大值，此时提取率为24.5%；当提取时间超过55min时，胶原蛋白提取率逐渐降低，但降低速度较缓慢。上述实验结果表明随着提取时间的增加，反应速率加快，当添加量达到一定程度时，反应速率基本不变，说明提取充分，产物浓度的增大对提取率有一定的抑制作用。因此，初步选择提取时间为55min为最佳时间。图2 提取时间对样品胶原蛋白提取的影响Figure 2 Effect of collagen extraction time on sample extract3.1.3料液比对样品胶原蛋白提取的影响不同料液比下对鱼皮胶原蛋白提取效率的影响见图3。由图3可知，在超声波处理35min（超声功率为100）的条件下，随着萃取剂乙酸的增加，胶原蛋白的提取率呈现先升高后降低的趋势。当乙酸与鱼皮比为（1:35）时，胶原蛋白提取率增加较快，提取率介于14%和21%之间；当料液比为（1:45）时，提取率达到最大值，此时提取率为21%；当料液比超过（1:45），未达（1:55）时，胶原蛋白提取率呈现缓慢降低的趋势；而超过（1:55）时，胶原蛋白提取率降低速度较快。以上实验结果表明胶原蛋白提取率随着萃取剂乙酸的增加，提取速率会受到影响，所以初步确定料液比为（1:45）为最佳比值。图3 料液比对样品胶原蛋白提取的影响Figure 3Effect of solid-liquid ratio on samples were extracted collagen3.2 正交设计试验鱼皮胶原蛋白提取正交试验设计及结果见表2，由表2可知：在3种提取条件中，超声功率( A) 极差最大，为1.806，胃蛋白酶加入量( B)其次，为1.680，酶解温度( C) 最小，为0.854。由此表明影响鱼皮胶原蛋白提取的主次因素顺序为超声功率胃蛋白酶加入量酶解温度。从各因素的水平看，A7、B7、C9组合的提取率应最大。但此组合不在正交试验中，作验证试验。试验结果为在该组合条件下，鱼皮胶原蛋白提取率为12.88%。由此优化出鱼皮胶原蛋白提取的最优条件为：以鱼皮为原料，超声功率为100%，胃蛋白酶加入量为2.5g，酶解温度为31，酶解时间为2h。表2 鱼皮胶原蛋白提取正交试验设计分析表Tab2 Test results carp skin collagen extraction orthogonal experimental design table试验号 超声功率（A，%） 提取时间（B ，g） 料液比（C） 胶原蛋白提取率（）111110.6212214.2313318.7421215.6522322.5623114731314.6832114.3933211.9K114.50013.60012.967K217.36717.00013.900K313.60014.86718.600R3.7673.4005.6334 结论我国水产资源非常丰富，以及对于大多数而言，鱼不像猪肉一样，由于宗教的问题很难推广，而且越来越多的人从健康养生的角度发现了吃鱼肉的好处，这可为鱼类加工产生的大量废弃物为胶原蛋白的提取提供了充足的来源以及广阔的市场前景，但是目前对于这些废弃物的利用较少，国内很少有专门的企业来做这件事。从这些废弃物中获取胶原蛋白可以有效地创新企业产品，增加企业效益，还能为大家带来好产品，健康的产品，而且还有效的减少了环境污染。目前, 在工业生产中, 鱼类胶原蛋白的比重很低, 即便是鱼类胶原的热变性温度一般低于陆地动物, 但这也是它优于陆生动物的地方, 利用超声提取鱼皮胶原蛋白, 其抗原性、过敏性相对都比较低, 这些特有的胶原蛋白特性，让其与陆生动物胶原蛋白竞争更有优势。本论文采用超声提取法对鱼皮胶原蛋白进行提取，选用称重法对鱼皮中胶原蛋白含量进行测定。首先利用单因素试验研究不同超声功率、不同提取时间、不同料液比3个因素对鱼皮胶原蛋白提取的影响，以确定正交试验所需水平， 后进行正交试验对提取工艺进行优化以确定胶原蛋白提取的最佳条件。结果显示：单因素试验中，选取超声功率为100%，提取时间为55min，料液比为1:45；正交实验设计优化的最佳提取条件为超声功率 100，提取时间为55min，料液比为1:45。在此最佳提取工艺条件下，鱼皮胶原蛋白的提取率为22.5%。目前的鱼类胶原蛋白提取普遍存在的问题是提取周期长，提取率不高，以及酸、碱等废液排放对环境造成影响，因此今后的在鱼皮胶原蛋白提取的科学研究方面，主要需要攻克的是提高其提取效率，缩短提取时间，尽最大的努力减小对环境的污染。另外，除了现阶段已有的提取胶原蛋白和明胶等产品，还要加大对这些废弃物潜在价值的挖掘，不断创新出新的产品。相信随着科技的不断进步，我们对鱼类加工废弃物的开发利用会越来越充分，其发展前景将十分广阔。参考文献1张培丽,周爱梅,刘欣,等.淡水鱼皮胶原蛋白提取工艺研究()J.食品与发酵工业,2006,32(12):150-1532AkkasitJongjareonrak,SoottawatBenjakul,WonnopVisessanguan,etal.Isolationandcharacterisationofacid andpepsin-solubilisedcollagensfromtheskinofBrownstriperedsnapper(Lutjanusvitta)J.Foodchemistry,2005,93:475-4843RuiDuan,JunjieZhang,XiuqiaoDu,etal.Propertiesofcollagenfromskin,scaleandboneofcarp(Cyprinuscarpio)J.Foodchemistry,2009,112:702-7064LinWang,XinxinAn,FangmeiYang,etal.Isolationandcharacterisationofcollagensfromtheskin,scaleandboneofdeep-searedfish（Sebastesmentella）J.Foodchemistry,2008,108:616-6235林琳,郑钰,吕顺,等.有机酸提取草鱼皮胶原蛋白的工艺研究J.安徽农业科学,2009,37(5):2246-22476Fu-YuanCheng,Feng-WenHsu,His-ShanChang,etal.Effectofdifferentacidsontheextractionofpepsin-solubilisedcollagencontainingmelaninfromsilkyfowlfeetJ.Foodchemistry,2009,113:563-5677陈静涛,徐政,顾其胜.胶原蛋白研发的最新进展J.上海生物医学工程,2004,25(2):52-558傅燕凤,沈月新.浅谈鱼皮胶原蛋白的利用J.食品研究与开发,2004,25(2):16-189曾名勇,张联英,李八方,等.几种鱼皮胶原蛋白的理化特性及其影响因素J.中国海洋大学学报,2005,35(4):608-61210LSSenaratne,Pyo-JamPark,Se-KwonKim.Isolationandcharacterizationofcollagenfrombrownbackedtoadfish(Lagocephalusgloveri)skinJ.Bioresourcetechnology,2006,97:191-19711 国家信息中心中国经济信息网,CEI中国行业