蛋白质与蛋白质DNA相互作用研究方法加实例 医学PPT.ppt

蛋白质与蛋白质的相互作用研究方法蛋白质与DNA相互作用研究方法 1 蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法 酵母双杂交系统YeastTwo HybridSysterm免疫共沉淀Co immunoprecipitation Co IP GSTpull down技术荧光共振能量转移FluorescentResonantEnergyTransfer FRET 双分子荧光互补 BimolecularFluorescentComplement BIFC蛋白质芯片技术其它方法 2 酵母双杂交系统 3 1 1酵母双杂交技术的原理酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构 而且也需要有反式转录激活因子的参与 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成 其中有DNA结合结构域 DNAbindingdomain DB 和转录激活结构域 activationdomain AD 它们都是转录激活因子发挥功能所必需的 单独的BD或AD都不能激活基因转录 但不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能 4 如果要研究两个蛋白之间有无相互作用 可以把这两个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白 与DB融合的蛋白称为 诱饵 bait 与AD融合的蛋白称为 猎物 prey 如果这两个蛋白能发生相互作用 这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子 从而激活报告基因 reportergene 的转录与表达 通过检测报告基因的表达产物 可判别 诱饵 和 猎物 这两个蛋白质之间是否存在相互作用 5 1 1酵母双杂交技术的原理 6 同时将上述两种载体转化改造后的酵母 这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4 又不能合成LEU TRP HIS ADE 因此 酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长 当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时 功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS ADE LACZ MEL1 从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落 7 1 2酵母双杂交操作主要流程1 分别构建BD和AD融合蛋白载体2 分别将重组载体转化酵母菌细胞3 对酵母转化子进行自激活检测4 将重组载体共转化酵母菌细胞5 检测报告基因表达产物6 分析酵母双杂交实验结果 BD AD BD AD BD AD x Y 8 IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex 实例 Method ForyeasttwohybridstudieswegeneratedtheconstructsFAM124B 1 3 pGADT7 transcriptvariant1 andFAM124B 1 2 pGADT7 transcriptvariant2 FAM124B 1 3 pGBKT7 transcriptvariant1 FAM124B 1 2 pGBKT7 transcriptvariant Thesebothplasmidswereco transformedintoY2HGoldstraincellstogetherwitheithertheCHD7 CR1 3 pGBKT7 aminoacids1591 2181 ortheCHD8 pGBKT7 aminoacids1789 2302 plasmids TserendulamBatsukh YvonneSchulz et al IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex PLoSOne 2012 7 12 e52640 9 Yeasttwohybridassay DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B 1 3 pGADT7 fulllengthtranscriptvariant1 andCHD7 CR1 3 pGBKT7 aminoacids1591 2181 demonstratingnodirectinteractionbetweenFAM124Btranscriptvariant1andtheCHD7part while B DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B 1 3 pGADT7 fulllengthtranscriptvariant1 andCHD8 pGBKT7 aminoacids1789 2302 showsadirectinteraction ThesameexperimentswereperformedforFAM124Btranscriptvariant2 C DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B 1 2 pGADT7 fulllengthtranscriptvariant2 andCHD7 CR1 3 pGBKT7 aminoacids1591 2181 D DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B 1 2 pGADT7 fulllengthtranscriptvariant2 andCHD8 pGBKT7 aminoacids1789 2302 FAM124Btranscriptvariant2interactsdirectlywiththeCHD8part whilenodirectinteractionwiththeCHD7partcouldbeobserved 10 酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋白质相互作用的技术 主要有二类载体 a含DNA bindingdomain的载体 b含Transcription activatingdomain的载体 另外还需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型 1 3应用 它可用于 检验蛋白质间的相互作用 分析蛋白质相互作用的结构域 发现新的作用蛋白质 11 1 4酵母双杂交技术的优点 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术 比体外的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况 基于基因重组技术和分子遗传学的原理 更便于观察和检测实验结果 酵母菌是一种低等真核微生物 能反映真核生物的基本生命现象和规律 4 酵母菌生长迅速 容易培养 便于进行高通量 大规模的组学研究 12 1 5酵母双杂交技术的弱点 1 假阳性 自激活 多因子参与 假阴性 毒性蛋白 膜蛋白 难表达的蛋白 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证 包括 体外相互作用验证体外亲和纯化 GSTpull down 体外免疫共沉淀 哺乳动物细胞内验证亚细胞共定位 体内免疫共沉淀 13 优点 生理条件下的结合缺点 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质 蛋白质相互作用 二 免疫共沉淀 2 1定义及原理免疫共沉淀 Co Immunoprecipitation 是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法 原理 当细胞在非变性条件下被裂解时 完整细胞内存在的许多蛋白质 蛋白质间的相互作用被保留了下来 如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x 那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来 这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合 也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 14 2 2方法1 收获培养的细胞 1 107 1 108 冷PBS洗涤2次2 细胞裂解液裂解细胞 冰浴30min3 12000rpm离心30min4 收集上清并加入适量抗体 4 C摇动1h 过夜5 加入ProteinA G Sepharose 琼脂糖凝胶 悬液 4 C摇动1h6 细胞裂解液洗涤ProteinA G Sepharose混合液7 离心弃上清8 沉淀加2 蛋白LoadingBuffer煮沸5 10min9 离心 上清液跑SDS PAGE胶10 考马氏亮兰染色 银染WesternBlot质谱分析 15 3 注意事项1 细胞裂解采用温和的裂解条件 不能破坏细胞内存在的蛋白质 蛋白质相互作用 多采用非离子变性剂 NP40或TritonX 100 每种细胞的裂解条件是不一样的 通过经验确定 不能用高浓度的变性剂 0 2 SDS 细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂 如商品化的cocktailer 2 使用明确的抗体 有的抗体不适宜做免疫共沉淀 3 对照实验的设计 16 IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex 实例 A Usingtheanti CHD8 abcam ab84527 ortheanti CHD7 abcam ab31824 antibodyforprecipitation wedetectedwiththeanti HAantibody Roche anapproximately51kDabandcorrespondingtotheestimatedsizeofFAM124Btranscriptvariant1 Lane1 co transfectedCo IP lane2 untransfectedHeLacellsasnegativecontrol 17 三 GSTpull down技术 3 1定义及原理 定义 该技术是通过以适当标签和目的基因进行融合表达作为诱饵 从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作用的蛋白 多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在琼脂糖树脂的反标签系统完成 原理 将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽 s 转移酶 glutathione transferase GST 标签融合表达 一步纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育 利用谷胱甘肽琼脂糖球珠将GST 融合蛋白 目的蛋白复合物沉淀下来 然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳 SDS PAGE 鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质 两种应用 1 确定融合 或探针 蛋白与未知 或靶 蛋白间的新的相互作用2 证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 18 3 2方法 1 GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育 a 单一明确的重组蛋白 b 细胞裂解蛋白混合液 c 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白 2 混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应4 C2h3 离心弃上清4 沉淀加入2 蛋白LoadingBuffer煮沸 离心5 取上清进行SDS PAGE电泳 6 考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带 进一步做质谱分析确定沉降的蛋白 电泳后的胶也可以做WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意 该实验设立GST对照 反应均在4 C进行 19 右边为GST对照 20 3 3GST融合蛋白沉降实验结果 CK2 GST TP1 GST Fig10GSTpulldownassayM proteinmolecularweightstandardLane1 GSTLane2 GST TP1 CK2 Lane3 CK2 21 3 4GSTpull down技术优缺点 优点 融合蛋白亲具有高通量性 高选择性的特点 由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性 如细菌 果蝇 哺乳动物 该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用 缺点 该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多 并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白 以及如何避免内源性诱饵蛋白的干扰 22 四 荧光共振能量转移 FRET Fluorescenceresonanceenergytransfer 4 1荧光信号的产生荧光基团在某波长的激发光刺激下 产生一个更长波长的发射光 23 4 2什么是FRET 荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象 当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠 并且两个分子的距离在10nm范围以内时 就会发生一种非放射性的能量转移 即FRET现象 使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多 荧光猝灭 而受体发射的荧光却大大增强 敏化荧光 实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽 24 4 3绿色荧光蛋白60年代 Shimomura等首先从水母 AequoriaVictoria 中分离出一种水母发光蛋白 aequoren 该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光 然而水母中提取的颗粒都呈绿色 后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP 后经研究表明 在水母体内Ca2 和肠腔素与水母发光蛋白结合后 水母发光蛋白产生蓝色荧光 GFP在蓝光的激发下 产生绿色荧光 25 26 人们在GFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白 黄色荧光蛋白 青色荧光蛋白 又发现了红色荧光蛋白 其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白 青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移 27 Tsien Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2 的浓度变化 他们将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内 当细胞内具有高的Ca2 浓度时 钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合 可诱发FRET 使受体蛋白YFP发出黄色荧光 因此细胞呈黄色 当细胞内Ca2 浓度低时 FRET几乎不发生 因此检测时CFP被激发 发出绿色荧光 细胞呈绿色 28 4 4应用 在生命科学领域 FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具 可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用 正如前述 当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠 并且两个探针的距离在10nm范围以内时 就会产生FRET现象 而在生物体内 如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内 一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用 29 五 双分子荧光互补技术 BiFC BimolecularFluorescenceComplementation 基本原理 方法利用绿色荧光蛋白 greenfluorescentprotein GFP 及其突变体的特性作为报告基因 将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段 再分别与目标蛋白连接 如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近 就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近 重新形成活性的荧光基团而发出荧光 在荧光显微镜下 就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用 并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间 位置 强弱等情况 30 将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段 分别与目标蛋白连接 如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近 就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近 重新形成活性的荧光基团而发出荧光 31 IdentificationoftheSIRTUIN1 SIRT1 bindingdomainofBMAL1 BindingofSIRT1toBMAL1deletionmutantswasanalyzedbybimolecularfluorescencecomplementation BiFC COS7cellsweretransfectedwithplasmidsencodingSIRT1 N terminalofVenus VN andBMAL1 C terminalofVenus VC wildtype WT oritsvariousmutants nuclearlocalizationsequence NLS BMAL1withoutafunctionalnuclearlocalizationsignal basic helix loop helix bHLH encodingBMAL1 71to140 Per Arnt Sim PAS A BMAL1 210to320 PAS B BMAL1 350to480 transcriptionalactivationdomain TAD BMAL1 553to625 Theimageswerecapturedbyfluorescenceimagingmicroscopyusingspecificfiltersetsforyellowfluorescentproteinandredfluorescentprotein 32 六 蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用 将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育 洗脱非特异性结合的蛋白后 可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点 33 GongW etal 2008 MolecularPlant1 27 41 34 其它蛋白互作技术 串联亲和纯化 TAP 表面等离子共振 SPR 噬菌体展示技术 phagedisplayapproach 融合蛋白亲和色谱法 proteinfusionaffinitychromatography 原子作用力显微技术 atomicforcemicroscopy AFM 35 蛋白质与DNA相互作用 一 酵母单杂交系统 Yeastone hybridsystem 该技术是上世纪90年代中发展起来的研究DNA 蛋白质之间相互作用的新技术 在酵母细胞内研究真核生物中DNA 蛋白质之间的相互作用 并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因 36 基本原理 将顺式作用元件与最基本启动子 minimalpromoter Pmin 相连并将报告基因连到Pmin下游 将待测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域 transcription activatingdomain A