生物方法鉴定纸张年代及对纸张老化的研究.doc

摘 要 纸张中存在易氧化变质的成分使纸张发生变化 如随着时间的推移会出 现发黄 变脆 边缘部分被降解 纸张中间出现色斑等情况 导致纸张无法 使用 记载文字丢失等现象 并且随时间的增长变化更加严重 在法化实验 室中 犯罪分子常以纸张作为各种信件 证书 契约等文件字迹和印章载体 或伪钞票及包装物等出现在现场上 在各类经济案件与经济纠纷中 作案人 或当事人常常在事后伪造文件来冒充原文上标称文件的时间 达到逃脱罪责 篡改事实的目的 在这种情况下 作为字迹的载体 纸张的鉴定成为鉴别文 件真伪的重要依据 因在这类案件的侦破过程中常常要求对收据 发票 借 条 公章 契约 合同 批件等可疑文件纸张的生产年代生产厂家进行鉴定 论文从纸张的老化的机理及生物和纸张成分等影响因素分析 采用生物 方法对纸张内的纤维素进行酶处理 通过对纸张滤液还原糖 纸张的黏度和 白度的分析 建立起他们和纸张生产年代的关系 从而为纸张年代的鉴定提 供理论依据 纸张内部的纤维素随着时间的增长会产生结构上的变化 纸张 的白度随着保存时间的增长而逐渐降低 粘度也逐渐变小 纸张酶解后的滤 液中还原糖的量在提高酶浓度的情况下随保存时间的增长有降低的趋势 关键词 纤维素酶 还原糖 白度 聚合度 ABSTRACT Oxidation paper exist in the composition of metamorphic change to make paper such as over time there will be yellow crisp edge part of the degradation paper etc among the emergence of stain resulting in the paper can not be used to record the phenomenon of language loss and changes over time the growth of even more serious In the laboratory the criminals are often a variety of paper as letters certificates contracts and other documents or writing and the seal carrier and the packaging of counterfeit banknotes and so on at the scene In all types of economic cases and economic disputes crime or the parties after the forged documents often come in posing as the original document on the nominal time to escape the guilt the purpose of distorting the facts In such a case as the carrier of writing paper the authenticity of identification documents has become important to identify the basis of such cases in the detection process is often asked for receipts invoices IOU official contract contracts documents and other suspicious documents during the production of paper to identify the manufacturer In this paper from the paper and biological mechanism of aging and the impact of paper components such as factor analysis the use of biological methods of cellulose paper for enzymatic processing paper filtrate by reducing sugar paper and whiteness of the viscosity of the analysis to establish them and the relationship between the age of paper production so as to provide identification of the paper s theory Cellulose within the paper s growth over time will change in the structure Whiteness of the paper with the increase in storage time decreased the viscosity is gradually getting smaller Filtrate after the hydrolysis of paper in the amount of reducing sugar to raise the case of enzyme concentration with time to preserve the trend of lower growth Key words Cellulase Reducing sugar Whiteness Olymerization degree 目 录 第一章 文献综述 1 1 1 纸张成分和老化现象 1 1 1 1 纸张成分 1 1 1 2 纸张老化现象 2 1 2 纸张的性能及老化的原因 2 1 2 1 纸张的性能 2 1 2 2 纸张内部成分及其变化 3 1 2 2 1 纸张中纤维素 3 1 2 2 2 纸张中的半纤维素 4 1 2 2 3 纸张中的木素 4 1 2 3 外部因素对纸张老化的影响 5 1 3 纸张耐久性 5 1 4 研究的内容和特点 7 第二章 实验材料与方法 8 2 1 实验试剂 8 2 2 实验仪器 9 2 3 样品及其预处理 9 2 3 1 纸张样品 9 2 3 2 纸张样品的预处理 10 2 3 3 纸样的水分含量测定 10 2 4 实验方法 11 2 4 1 DNS 法对纸张酶解液中还原糖的测定 11 2 4 1 1 溶液的制备 11 2 4 1 2 葡萄糖标准曲线的绘制 11 2 4 1 3 纤维素酶的活性测定 12 2 4 1 4 纤维素酶反应的部分条件的确定 13 2 4 1 5 纤维素酶反应的时间的测定 13 2 4 1 6 纤维素酶浓度与底物的比例关系 13 2 4 1 7 纸张酶解液中还原糖的测定 14 2 4 2 纸张粘度的测定 14 2 4 2 1 铜乙二胺溶液的配制 14 2 4 2 2 铜乙二胺溶液的测定要求 16 2 4 2 3 粘度的测定 17 2 4 3 纸张白度的测定 18 第三章 结果与讨论 19 3 1 纸张酶解液中还原糖的测定 19 3 1 1 纤维素酶的活性测定 20 3 1 2 纤维素酶反应时间的测定 20 3 1 3 纤维素酶浓度与底物的比例关系 21 3 1 4 纸张酶解液中还原糖的测定 22 3 1 4 1 含墨纸张与不含墨纸张的酶解液中还原糖比较 23 3 1 4 2 75g 双面铜版纸的纤维素酶水解及分析 23 3 1 4 3 50g 书写纸的纤维素酶水解及分析 25 3 2 纸张粘度的测定 26 3 2 1 铜乙二胺溶液的标定 26 3 2 2 纸张粘度的测定 27 3 2 2 1 含墨纸张与不含墨纸张的聚合度比较 27 3 2 2 2 75g 双面铜版纸的聚合度测定及分析 28 3 2 2 3 50g 书写纸的聚合度测定及分析 29 3 3 纸张白度的测定 31 3 3 1 75g 铜版纸的白度测定及分析 31 3 3 2 50g 书写纸的白度测定及分析 32 第四章 结论 33 参考文献 34 致谢 35 第一章 文献综述 1 1 纸张成分和老化现象 1 1 1 纸张成分 纸张由植物纤维 填料 胶料 色料等组成 植物纤维是纸张的基本组 成部分 作为造纸原料的植物纤维必须具备在制浆时易于离解 植物纤维中 的纤维素含量高 木质素含量少 合乎要求的强度 长度和宽度 具有足够 的弹性与交织能力 来源丰富和成本低廉 适应大量生产等条件 我国常用 的造纸植物纤维有 稻草 麦草 芦苇 竹 木材 麻类 棉花等 废棉 废布 废麻 废纸等也是造纸的主要原材料 在制造纸浆的过程中 将植物 纤维经理加工处理 去掉植物纤维中含有的木质素 果胶 树脂 脂肪等其 他成分 仅保留纤维素和半纤维索等有效成分 纸张的性质 在一定条件下 取决于所选用的植物纤维的物理化学性能 以及制浆方法 1 相互交织的纤维构成的纸 有许多空隙 必须添加填料填塞 增加柔韧 性 减少纸的透明度和伸缩性 使表面均匀 适应使用的要求 常用的填料 有高岭土 滑石粉 石膏粉 碳酸和硫酸钡等 一般印刷用纸选用滑石粉 高级印刷用纸采用高岭土和硫酸钡 填料的用量 一般占 20 左右 填料过 多会影响纸张质量 降低抗张力和韧性 阻碍油墨的吸收 印刷时容易掉粉 加入胶料是为了填塞纸张表面的间隙 减少纸张中的毛细管作用 提高 纸张的抗水性 施胶后还能起到改善纸张的光泽 强度和防止纸面起毛等作 用 常用的胶料有松香 硫酸铝 明矾 淀粉 水玻璃 干酪酸等 根据各 种纸张的使用要求不同 有各种施胶方法 有纸内施胶 表面施胶 重施胶 和轻施胶等 2 施胶量相差很大 从占浆料重量的 0 25 9 不等 施胶过量 也会影响纸张的吸墨性能 植物纤维有一定的颜色 经漂白后仍不纯白 而是略带一些浅黄或浅绿 色 不能满足造白纸的要求 因此要加入色料进行调色与增白处理 造白纸 常用的色料为品蓝 群青等 造高级纸要加入一定的荧光增白剂 在制造有 色纸时 也需要使用色料 大都使用无机颜料或有机染料 1 1 2 纸张老化现象 由于纸张中存在易氧化变质的成分是纸张发生变化 随着时间的推移会 出现发黄 变脆 边缘部分被降解 纸张中间出现色斑等情况 3 致使纸张 无法使用 记载文字丢失等 并且随时间的增长变化更加严重 在外界各种不利环境作用下 纸张主要化学成分发生不可逆的化学变化 从而使纸张性能下降 我国现在的档案绝大多数是纸质当档案 今年来 关 于图书 档案老化自毁的可怕性已被世界各国所公认 因此 防止图书 档 案纸张的老化问题的研究 也引起人们的普遍关注 微观表现 纤维素 半 纤维素和木质素的化学结构发生变化 宏观表现 纸张泛黄 白度下降 机 械强度下降 铜价上升 酸度上升 PH 值减小 4 1 2 纸张的性能及老化的原因 1 2 1 纸张的性能 纸张与古代其他文字载体材料相比 有纸草之便 不易破裂 有竹木之 廉 体积不大 有缣帛羊皮之软 无其贵 有金石之坚 而不笨重 纸张的 性能分为四类 第一类 物理性能 包括定量 厚度 紧度 透气度 施胶度和吸收性 等 第二类 光学性能 包括白度 不透明度等 第三类 机械性能 机械 强度 包括抗张强度 耐破度 耐折度和撕裂度等 第四类 化学性能 包括化学成分的含量 水分 PH 值 灰分 铜价和粘度等 4 1 2 2 纸张内部成分及其变化 在外界各种不利环境作用下 纸张主要化学成分发生不可逆的化学变化 从而使纸张性能下降 纸张主要化学成分的变化包括维素和半纤维素水解 5 氧化 氧化降解 光解 光氧化作用 木质素氧化和光解反应 其中纤维素 半纤维素 木质素 表示分子稳定性 不宜老化程度 纸张生产过程中残留 的酸 氧化剂 施胶明矾 金属离子等有害物质也会导致纸张老化 1 2 2 1 纸张中纤维素 纤维素的直链结构有利于纸张耐久性 直链分子之间容易靠近 分子间 作用力 范德华力 大 耐久性好 纤维素分子之间能形成氢键 有利于纸 张的耐久性 纤维素分子间成千上万个氢氧基靠近到 2 6nm 的距离内时 一 个纤维素分子链上 OH 中的 H 原子与另一个纤维素分子链上 OH 的 O 原子互相吸引形成氢键 靠静电引力相结合 OH O 分子链越长 氢 键结合越多 键能总和越大对纸张强度贡献越大 由于氢键的作用 若干个 纤维素分子排列整齐有序 相互靠的很近 形成的结晶状态称为结晶区 6 结晶区内有害物质和水分难以侵入 纤维素分子不易产生有害反应 提高纸 张耐久性 纤维素是由若干个 葡萄糖脱水聚合形成的直链高分子化合物 前一个 葡萄糖上 C1的 OH 和后一个 葡萄糖 C4上的 OH 脱去一个 H2O 以氧桥即甙键 O 相连 纤维素分子式 C6H10O5 n 其中 C6H10O5为葡萄 糖基 n 为聚合度 n 表示纤维素长度 n 越大 链越长 甙键越多 纸张纤 维耐久性越好 纤维素分子在一定条件下分子上的 OH 被氧化剂氧化生成含 CHO CO COOH 等 生成与原来纤维素结构不同的氧化纤维素 影响纤维素氧化 的因素有 氧化剂的种类与数量 光 水分 空气湿度或纸张含水量 温度 等 纸张上富集的微生物分泌纤维素酶 纤维素酶作用的底物比较复杂 反 应产物不同 纤维素分子在一定条件下与纤维素酶发生水分解反应 1 4 糖甙键 C1 O 断裂 水分子加入 生成比原来纤维素分子链短的一群 物质 即水解纤维素的过程 影响纤维素水解的因素有 水分 空气湿度或 纸张含水量 酸的催化能力与种类 微生物分泌的胞外酶 温度 纤维的种 类等 7 1 2 2 2 纸张中的半纤维素 半纤维素是由木糖 阿拉伯糖 甘露糖 葡萄糖等非均一单糖脱水聚合 形成的高分子化合物 聚合度较纤维素小 有支链 分子间除了有 C1 和 C4 的 OH 脱水外 还有 C1和 C6的 OH 脱水形成的甙键相连 与纤维素相比 半纤维素容易发生水解 氧化和光解反应 难以产生氢键和结晶区 从而容 易溶于碱溶液 它吸水膨胀 呈现粘滑性 便于打浆 易使纤维解离 半纤 维素的稳定性要比纤维素差 适量的半纤维素可以提高纸张强度 4 1 2 2 3 纸张中的木素木素 木素是十多个或二十多个苯基丙烷为结构单元相互连接而成的三维空间 立体网状高分子化合物 上面有许多活泼基团 如 OH CH3O CHO COOH C C 等 存在于维管束中 木材中含量达 20 30 在天然情况 下 它与纤维素 半纤维素一起 形成植物骨架的主要成分 在数量上仅次 于纤维素 木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度 利于输导组 织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭 木素一面引起细胞壁的次生变化 一面堆积起来起着强固植物的作用 一般认为与陆地上高等植物的进化发生 有着密切关系 木素是由四种醇单体 对香豆醇 松柏醇 5 羟基松柏醇 芥子醇 形 成的一种复杂酚类聚合物 是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高 分子 木素不溶于水 常温下不溶于稀碱 稀酸溶液 高温下能与一定浓度 的酸和碱作用而溶解 如碱木素 磺化木素均溶于水 将网状立体结构的不 溶性木素大分子降解为易溶性的小分子并溶解于蒸煮液中 使纤维细胞分离 开来且变得比较疏松柔软 化学纸浆去除木素以此为原理 另外 木素还能 被某些氧化剂氧化 这一性质在被应用于造纸漂白工艺之中 7 木素的结构及其复杂 木素功能团化学性质不稳定 反应能力强 容易 形成氧化木素 氧化后苯环结构受到破坏 生成大量低分子化合物 纸张发 黄 发脆 易碎 2 1 2 3 外部因素对纸张老化的影响 在碱性纸张老化中 对纤维素自动氧化降解具有促进作用的影响因素有 较高的 pH 过渡金属离子和能引发自由基反应的物质 引发剂 等 8 此外 高温 高湿 光线 酸 氧化剂 微生物等加速发生水解 氧化和光解反应 也可以促使纸张老化的发生 9 其中微生物会分泌出纤维素酶 纤维素酶会催化纤维素分子发生水解反 应 是纤维素长链不断从末端脱下一个葡萄糖分子 产生 剥皮 效应 10 最终是纤维素的聚合度大大降低 是纸张产生老化 同时微生物在新陈代谢 过程中会合成各种次生代谢物 这些代谢物分泌出体外 是菌落所在的地方 出现黄 褐 黑等色 使得纸张受污染 11 自由基是促使纸张老化的一个重要因素 12 在中性和碱性条件中 自动 氧化反应是纤维素降解的重要原因 纤维素的自动氧化机理可应用于碱性纸 张的老化研究 添加碘化钾等抗氧化剂能够降低碱性纸张老化的速度 1 3 纸张耐久性 有关纸张耐久性的定义 不同的研究组织虽然在概念上都能达到共识 但在具体的描述上 还存在着一定的分别 举 ISO The International Organization for Standardization 和 ANSI American National Standards Institute 这两个组织为例 前者对纸张耐久性这个术语的定义 是纸张经过一段长时间后依然能保持它在物理及化学上的稳定性 而后者则 对纸张耐久性有更详细和具体的描述 她的定义是纸张于书库或文件保管库 的正常使用及存放环境下 于最少数百年的时间后 该纸张不会出现明显的 变坏 以上于定义中所提及的纸张变坏 一般会理解为纸张特性上的改变 而较为人认识的 莫过于纸张的强度和纸张的光亮度 量度纸张变黄的指标 3 纸张上的各种物理和化学特性之所以会随时间而改变 主要是因为纸张 中纤维的组合物纤维素和半纤维素分子不断进行水降解反应 而降解的速度 则取决于温度 纸张的水含量 即存放环境的相对湿度 及纸张的酸碱度 有 研究显示 酸碱度在纸张的耐久性上扮演着重要的角色 而我们一般应用于 印刷的纸张 大部份都属于酸性纸张 它会加快纸张老化的情况 13 而纸张 中酸性成份则来自于造纸过程中的漂白剂 纤维素及半纤维素降解中所产生 的化学物质 由于属于酸性 故此这种化学物质会进一步催化纤维降解 纸 张上的施胶料 以为纸张上组成物的黏合剂 并能改善纸张的吸水情况 一般 会使用带有酸性的明矾 松香 纸张上的填充料 除纤维外 另一种组成纸 张的物料 主要用于填满纤维与纤维的空间 并给予纸张一定重量 涂剂等 如我们要纸张拥有一定的耐持久性 在造纸过程中 我们可以使用中性或碱 性的施胶料 并同时使用碱性的填充料如碳酸钙等材料 造出碱性纸张 碱 性纸张好处在于能把纤维降解所产生的化学物质 印刷油墨 其他污染物所 带的酸性中和 2 ANSI 亦有明确指出 有耐久性纸张的酸碱值应界定于 pH7 5 至 pH10 之间 如果我们要减低纸张的老化速度 除了从纸张本身着手外 保存环境都 需要严格控制 温度上升 水份混合空气中的氧气 对纤维素进行氧化作用 光线 特别是天然光和紫外光 空气中的污染物 都会趋化纤维素分解出有 机的酸性物质 加速纸张老化 14 故此对于一些重要的文件或书籍 应贮存 于没有光线 有洁净空气 适当而又稳定的温度和湿度下 一直以来很多研究组织 例如 TAPPI Technical Association of the Pulp Paper ASTM American Society for Testing and Materials ISO 等都希望把纸张天然的老化情况以人工老化的方法完全地模拟出来 一般来 说 这样做是希望以人工的方法加快纸张的老化过程 我们更能够于短时间 内 预测到纸张的耐久性及经过一般长时间后于纸张成份和特性上的改变 各组织都订立出不同的测试方法给大家依循 举 TAPPI 测试方法 T544 为例 它就是把纸张放置于 50 相对湿度 90 温度的环境下一段长时间 来研 究纸张的老化情况 6 由于纸张存放的温度和湿度需要长期控制在一个稳定 的水平 所以要进行这类型测试 一般都要配备有自动监控温度和湿度功能 的环境厅来达到测试的基本要求 而对于要预测纸张老化过程对纸张特性所 带来的影响 我们的做法是把经人工老化处理前和处理后的纸张来进行纸张 特性测试 并加以比较便成 而纸张特性测试上的选择要视乎用家的实际需 要 可以是纸张的机械特性测试如耐折度 抗张强度 抗撕裂强度 纸张光 学特性测试如光亮度 不透光度 化学特性测试如酸碱度 2 但有一点值得 留意的 到现时为止 纸张的人工老化测试 只在控制的环境下 加快纸张 的老化过程 得出的效果也不尽与天然的纸张老化过程相同 故此不同人士 对老化测验可能会存在着不同的理解 举例说 有人会定义把纸张放进 100 的环境下 3 日 等同于天然环境下的 25 年 但亦有人理解为 300 年 由此可见 利用人工老化方法测试得出来的结果 还存在着很多未能确定的 地方留待研究 所以现阶来说 经人工纸张老化测试出来的结果 较适用于 作为研究和参考的用途 1 4 研究的内容和特点 纤维素是纸张的主要成分 纸张在不同的环境下保存 在温度 酸 湿 度 灰分 微生物等众多的外界条件共同作用下 其中的纤维素等物质会发 生结构上的变化 在纤维素酶的作用下 纤维素发生水解反应 纤维素链上 会不断有葡萄糖分子被切割下来 纤维素聚合度降低 粘度降低 本实验通 过对以上因素的分析 找到一个与纸张保存时间相联系的纽带 在科技发展迅猛的今天 生物技术已经被应用到更广泛的领域 纸张在 保存过程中 在酸 碱 金属离子等外界因素的作用下会使部分纤维素链断 裂 聚合度降低 形成少量的低聚糖 并被微生物利用 纸张中剩余的纤维 素含量随保存时间的增长而减少 实验的特点是 用较高浓度的纤维素酶水 解纸张中的纤维素 使纤维素中剩余的非结晶区全部水解 纤维素中结晶区 部分水解 在同样的酶解条件下 测得的水解产物的量会成规律性变化 通 过纸张酶解的途径为纸张的生产年代的鉴定提供一种新的方法 第二章 实验材料与方法 2 1 实验试剂 纤维素酶 肇东市日成酶制剂有限公司 酒石酸钾纳 国营烟台葡萄酿酒公司 3 5 二硝基水杨酸 北京化工厂 氢氧化钠 沈阳市新西试剂厂 无水亚硫酸钠 东海化工厂 重蒸酚 沈阳试剂一厂 葡萄糖 天津市科密欧化学试剂开发中心 盐酸 北京化工厂 氯化钠 天津市广成化学试剂有限公司 冰乙酸 天津市博迪化工有限公司 无水乙酸钠 天津市科密欧化学试剂开发中心 羧甲基纤维素钠 上海化学试剂采购供应站 硝酸钠 沈阳市新西试剂厂 磷酸氢二钾 天津广成化学试剂有限公司 七水合硫酸镁 沈阳市新城化工厂 氯化钾 天津基准化学试剂有限公司 硫酸铁 沈阳市试剂三厂 蔗糖 沈阳市试剂三厂 硫酸铜 天津基准化学试剂有限公司 氨水 山东三和化工有限公司 乙二胺 美国陶氏化学试剂有限公司 2 2 实验仪器 WSB 白度计 温州仪器仪表有限公司 HH 恒温水浴锅 余姚市检测仪表厂 SHZ D 循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂 电子天平 上海精密科学仪器有限公司 恒温水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂 Unic 722s 可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 701 型电热干烘箱 大连干燥箱厂 打浆机 博朗电器有限公司 52ml 的细口聚乙烯瓶 大连工业大学提供 毛细管粘度计 大连工业大学提供 2 3 样品及其预处理 2 3 1 纸张样品 1 75g 双面铜版纸 选用 辽宁警专学报 双月刊 2009 年第 1 期 总期第 53 期 1 月 10 日出版 2008 年第 5 期 总期第 51 期 9 月 10 日出版 2007 年第 6 期 总期第 46 期 11 月 10 日出版 2007 年第 5 期 总期第 45 期 9 月 10 日出版 2007 年第 2 期 总期第 42 期 3 月 10 日出版 2006 年第 5 期 总期第 39 期 9 月 10 日出版 2006 年第 4 期 总期第 38 期 7 月 10 日出版 2005 年第 6 期 总期第 34 期 11 月 10 日出版 2 50g 书写纸 选用辽宁警官高等专科学校考试试卷 2007 2008 学年第二学期 2008 年 7 月 2007 2008 学年第一学期 2008 年 1 月 2006 2007 学年第二学期 2007 年 7 月 2006 2007 学年第一学期 2007 年 1 月 2005 2006 学年第二学期 2006 年 7 月 2004 2005 学年第二学期 2005 年 7 月 2 3 2 纸张样品的预处理 按纸张年代不同 分别称取各个年代的纸样 25 30 克 剪成约 1 5cm 1 5cm 的小块 放入 500ml 去离子水中浸泡约 10 个小时 泡纸的水 颜色变为淡黄 泡好的纸样加入 1000 ml 去离子水 用打浆机打成纸浆 再 将纸浆抽虑 先加入 500ml 去离子水 用玻璃棒搅拌 充分洗涤后抽滤 如 此反复 3 次 抽虑成纸饼 再向冷水洗涤后的滤饼中加入 500ml 沸水 沸水 浴 30min 后抽滤 然后加入 500ml 沸水 用玻璃棒搅拌 充分洗涤 然后抽 滤 如此反复 3 次 抽虑成纸饼 将同一批次抽虑的纸饼放在一起压实 装 入软塑料袋中 赶出袋中的空气 密封好塑料袋 放入冰箱冷藏箱中 4 条 件下放置 10 个小时以上 以此达到水分的平衡 处理好的纸样在冷藏箱中保 存 11 2 3 3 纸样的水分含量测定 绝干纸样 在 105 条件下水分全部散失后的样品 准确称取平衡好水分的纸样 1 克 精确到小数点后 4 位 放入电热干烘 箱中 在 105 条件下烘干 4 5 个小时 纸张中的水分全部散失 达到恒 重 在干燥条件下准确称量纸张重量 并计算平衡水分后的纸张含水量 纸 样中的绝干纸在 34 39 之间 计算出含 1 克绝干纸样的样品重量 将 样品按照 1 克绝干纸样分装 装入小自封袋中 放入冰箱冷藏保存 通过对原料的预处理 提高底物对酶的敏感性 15 2 4 实验方法 2 4 1 DNS 法对纸张酶解液中还原糖的测定 2 4 1 1 溶液的制备 1 3 5 二硝基水杨酸试剂 DNS 的制备 称取 182 克酒石酸钾钠加入到 500ml 的热蒸馏水中溶解 再称取 6 3 克 DNS 和 262ml 浓度为 2mol L 的 NaOH 加入到溶液中 再加入 5 克重蒸酚和 5 克亚硫酸钠 搅拌溶解 冷却后加水定容至 1000ml 置于棕色瓶中保存 静 至一周后使用 2 葡萄糖标准溶液 1000 g ml 的制备 准确称取干燥恒重的葡萄糖 1 克 加入少量水溶解 再加入 8ml 浓度为 12mol L 的浓盐酸 用蒸馏水定容至 1000ml 3 pH4 8 乙酸 乙酸钠缓冲溶液的制备 称取 13 61 克 NaAC 3H2O 或 8 21 克无水乙酸钠 定容到 500 ml 配制 成 0 2mol L 的乙酸钠溶液 称量 6ml 乙酸定容到 500ml 配制成 0 2mol L 的 乙酸溶液 取 0 2mol L 的乙酸钠溶液 500ml 和 0 2mol L 的乙酸溶液 347 5ml 溶于一起 按体积比 5 9 4 1 2 4 1 2 葡萄糖标准曲线的绘制 1 标准葡萄糖梯度溶液的配制 取 5 支比色管 分别按表 2 1 加入试剂 表 2 1 标准葡萄糖梯度溶液配制表 试剂 12345 葡萄糖标准溶液 1000 g ml 1 12468 蒸馏水加入量 ml 98642 葡萄糖最终浓度 g ml 1 100200400600800 2 绘制标准曲线 另取 6 支比色管 前 5 支比色管中分别加入上述不同梯度葡萄糖溶液 1ml 第 6 支比色管中加入蒸馏水 1ml 然后向各支比色管中再加入 DNS 试剂 1ml 沸水浴加热 5min 取出冷却后再分别加入蒸馏水 8ml 摇匀 以第 6 支 比色管作为空白 使用分光光度计在 540nm 处测定吸光值 用吸光值作为纵 坐标 葡萄糖含量作为横坐标 绘制标准葡萄糖曲线 如图 2 1 图 2 1 葡萄糖标准曲线 2 4 1 3 纤维素酶的活性测定 称取 0 1 克纤维素酶以 pH 为 4 8 的缓冲液定容到 200ml 摇匀备用 冰 箱冷藏保存 取 4 支比色管分别加入 pH 为 4 8 的羧甲基纤维素钠溶液 0 9ml 50 水 浴 5min 预热 再向其中 3 支管中加入配制好的纤维素酶液 0 1ml 另 1 支管 中加入 0 1ml 去离子水 4 支比色管在 50 水浴条件下反应 20min 17 18 后 立即放入沸水锅加热 20min 灭活 用流动自来水迅速冷却 分别向 4 支比色 管中加入 1ml DNS 试剂 沸水浴加热 5min 显色 取出冷却后再加入去离子水 8ml 摇匀 在分光光度计 540nm 处测定吸光值 计算纤维素酶的酶活 18 酶活定义 在 50 pH4 8 的条件下 1 克酶粉 1min 水解羧甲基纤维素钠溶 液 生成 1mg 葡萄糖的量为一个酶活单位 酶活力 葡萄糖量 g ml 200ml 0 1g 20min 1000 公式 2 1 2 4 1 4 纤维素酶反应的部分条件的确定 纤维素酶作用的底物比较复杂 反应产物不同 纤维素分子在一定条件 下与纤维素酶发生水分解反应 1 4 糖甙键 C1 O 断裂 水分子加入 生成比原来纤维素分子链短的一群物质 即水解纤维素的过程 影响纤维素 水解的因素有 水分 空气湿度或纸张含水量 酸的催化能力与种类 微生 物分泌的胞外酶 温度 纤维的种类等 7 选取 490 580nm 波长对显色液进行比色 不同浓度的葡萄糖溶液在 490 540nm 处有最大吸收 DNS 在此波长下也有较明显的吸收 为了排除 DNS 的干扰 选择在波长 540nm 出进行测定 此波长下的葡萄糖吸收符合 吸收最大 干扰最小 的原则 18 确定实验用纤维素酶的最适 pH 为 4 8 最适温度为 50 2 4 1 5 纤维素酶反应的时间的测定 称取 0 1 克纤维素酶以 pH4 8 的缓冲液定容到 200ml 摇匀备用 操作 两次 得到 400ml 纤维素酶液 取 6 个 500ml 三角瓶 每个瓶中加入 40ml 配好的酶液 放入 50 水浴 锅内预热 5min 取 2007 年 3 月的 1 克绝干纸样 6 份 加入到装有酶液的 6 个三角瓶中 分别在 50 的条件下反应 0 5 小时 1 小时 1 5 小时 2 小时 2 5 小时 4 小时 至反应时间终点时立即用流动自来水冷却三角瓶 将反应 液用滤纸过滤 10s 后得到的滤液倒入比色管中放进沸水锅加热 20min 灭活 用流动自来水迅速冷却 再取 2 支比色管分别加入 1ml 灭活滤液和 1ml 去离 子水 分别加入 1ml DNS 试剂 沸水浴加热 5min 显色 取出冷却后再加入去 离子水 8ml 摇匀 在分光光度计 540nm 处测定吸光值 以生成的葡萄糖量 为纵坐标 时间为横坐标 绘制纤维素酶反应时间曲线 2 4 1 6 纤维素酶浓度与底物的比例关系 分别称取 0 03 克 0 05 克 0 08 克 0 1 克 0 12 克的纤维素酶以 pH 为 4 8 的缓冲溶液定容到 200ml 摇匀备用 取 5 个 500ml 三角瓶 依次加入 40ml 上述浓度的纤维素酶液 放入 50 水浴锅内预热 5min 取 2007 年 3 月的 1 克绝干纸样 5 份 加入到装有 不同浓度酶液的 5 个三角瓶中 在 50 的条件下反应 1 小时 至反应时间终 点时立即用流动自来水冷却三角瓶 将反应液用滤纸过滤 10s 后得到的滤液 倒入比色管中放入沸水锅加热 20min 灭活 再取 6 支比色管 前 5 支依次加 入 1ml 上述灭活滤液 第 6 支加入 1ml 去离子水 6 支比色管分别加入 1ml DNS 试剂 沸水浴加热 5min 显色 取出冷却后再加入去离子水 8ml 摇匀 在分光光度计 540nm 处测定吸光值 以生成的葡萄糖量为纵坐标 纤维素酶 浓度为横坐标 绘制纤维素酶浓度与底物的比例关系的曲线 每个浓度的酶 液做三次平行实验 2 4 1 7 纸张酶解液中还原糖的测定 分别称取 0 1 克 0 15 克的纤维素酶以 pH 为 4 8 的缓冲溶液定容到 200ml 摇匀备用 冰箱冷藏保存 在 500ml 三角瓶中加入 40ml 配制好的纤维素酶液 放入 50 水浴锅内 预热 5min 再加入 1 克绝干纸样 在 50 的条件下反应 1 小时 至反应时间 终点时立即用流动自来水冷却三角瓶 将反应液用滤纸过滤 10s 后得到的滤 液倒入比色管中放入沸水锅加热 20min 灭活 对灭活液稀释相应的倍数 酶 浓度为 50mg 100ml 的酶液稀释 1 倍 酶浓度为 75mg 100ml 的酶液稀释 2 3 倍 取 1ml 稀释后的灭活酶液于新的比色管中 以去离子水作为空白样 分 别加入 1ml DNS 试剂 沸水浴加热 5min 显色 取出冷却后再加入去离子水 8ml 摇匀 在分光光度计 540nm 处测定吸光值 同一年代的纸样做三次平行 实验 以生成的葡萄糖量为纵坐标 以纸样年代为横坐标 绘制还原糖生成 曲线 还原糖量 OD 值 0 0102 0 0005 稀释倍数 样品量 1000 公式 2 2 2 4 2 纸张粘度的测定 2 4 2 1 铜乙二胺溶液的配制 分析时使用分析纯试剂 并使用蒸馏水或去离子水 1 制备法 溶解 250 克分析纯硫酸铜 CuSO4 5H2O 于成有 2000ml 热蒸馏水的烧杯中 加热至沸腾 冷却至约 45 在不断搅拌下 慢慢加入 浓氨水 至溶液呈淡紫色 约需要加入浓度为 25 28 氨水 300ml 左右 静置是沉淀下降 用倾泻法洗涤沉淀 先用热蒸馏水洗涤四次 再用冷蒸馏 水洗涤二次 每次约用 1000ml 蒸馏水 将湖状沉淀冷却至 20 以下 最后 在 10 以下 在剧烈搅拌下慢慢加入 800ml 冷的 100g L NaOH 溶液 以倾 泻法用蒸馏水洗涤沉淀出的氢氧化铜 至洗液用酚酞指示剂检验无色为止 在不断搅拌下 慢慢向湖状沉淀中加入 110g 乙二胺 以 100 计 使之溶 解 加入时注意保持温度低于 20 然后用水稀释至 800ml 置于带塞的棕 色瓶中 配好的溶液静置一两天后 慢慢倒出上层清液 将清液量好体积 置于棕色瓶至保存 以备标定 2 标定 用移液管吸取 25ml 配好的溶液于 250ml 容量瓶中 用水稀 释至刻度 用移液管吸取 25ml 稀释液 置于 500ml 带磨口塞的锥形瓶中 加 入 25ml 1mol L HCL 标准液及 30ml 10 100g L KI 溶液 摇匀后 立即用 0 1mol L Na2S2O3标准溶液 静置一周 滴定至棕色几乎消失时 加入 1 克硫 氰酸铵及酚酞指示剂 继续滴定至蓝色消失为止 记录所耗用的硫代硫酸钠 标准溶液体积 向上述溶液中多加 5 滴硫代硫酸钠溶液 再加入 200ml 蒸馏水 摇匀 用甲基橙为指示剂 以 1mol L NaOH 标准溶液滴定至显黄色 即为终点 铜乙二胺溶液浓度标定的反应方程式为 Cu en 2 OH 2 2HCl Cu en 2Cl2 2H2O Cu en 2Cl2 4HCl CuCl2 2 en 2HCl Cu en 2 OH 2 6HCl CuCl2 2H2O 2 en 2HCl 2CuCl2 4KI Cu2I2 4KCl I2 3 计算 c4 c1V1 2c2V2 c3V3 2V 公 2 3 式 c5 c2V2 V 公 2 4 式 R c4 c5 公 2 5 式 式中 V 用于滴定的铜乙二胺溶液的体积 ml V1 加入的 1 0 mol L HCl 标准溶液的体积 ml c1 HCl 标准溶液的浓度 mol L V2 滴定是耗用的 Na2S2O3标准溶液的体积 ml c2 Na2S2O3标准溶液的浓度 mol L V3 滴定时耗用的 NaOH 标准溶液的体积 ml c3 NaOH 标准溶液的浓度 mol L c4 铜乙二胺溶液中乙二胺的浓度 mol L c5 铜乙二胺溶液中铜的浓度 mol L R 乙二胺与同的浓度比例 mol L R 要求为 2 00 0 04 铜的浓度 c5为 1 00 0 02 mol L 如果分析 结果 R 2 c5 1mol L 说明乙二胺和水量不够 则可按下式计算 加入 一定量的乙二胺和蒸馏水 以配制所需浓度的铜乙二胺溶液 a 需加入乙二胺的量 V4 V4 2c5 c4 6 0V0 w 公 2 6 式 式中 V0 原始溶液量 ml w 乙二胺的质量分数 b 需配制的铜乙二胺溶液总量 V5 V5 c5V0 公 2 7 式 c 需加入的蒸馏水量 V6 V6 V5 V4 V0 公 2 8 式 65 甘油水溶液 20 相对密度 1 167 粘度约为 10mPa s 2 4 2 2 铜乙二胺溶液的测定要求 1 容积约为 52ml 的细口聚乙烯瓶 当容器中装入 50ml 溶液时 残留 的空气能排出 排出空气后盖好橡皮塞或带有密封垫的罗口盖 2 带有水套的校准用毛细管粘度计 要求 25 的蒸馏水在此粘度 计中流出时间约为 60s 粘度计规格如图 2 2 a 带有水套的测定用毛细 管粘度计 规格如图 2 2 b 粘度计须使粘度为 11mPa s 的溶液 流出时 间约为 100s 速度梯度 Gmax约为 200s 1 速度梯度计算 Gmax 4V r3t 公 2 9 式 式中 V 流出容积 cm r 毛细管内半径 cm t 流出时间 s 3 恒温水浴 能控制在 25 1 并装有自动循环泵 4 铜片 约 5mm 5mm 由电解铜制造 5 天平 感量 0 0001 克 6 秒表 图 2 2 毛细管粘度计 2 4 2 3 粘度的测定 1 毛细管粘度计的校准 用 65 甘油水溶液 蒸馏水及稀的铜乙二胺溶液 取一定量配制好的 铜乙二胺溶液加入等量蒸馏水配制成 分别调整至 25 1 在校准用 粘度计中测定其流出时间 然后在测定用粘度计中测定同一甘油水溶液流出 时间 用下式计算粘度计因子和粘度计常数 粘度计因子 fn tkg tng 公 2 10 式 粘度计常数 hn s 1 fn tKCED 公 2 11 式 式中 tkg 甘油溶液在校准用粘度计中的流出时间 s tng 甘油溶液在测定用粘度计中的流出时间 s tKCED 稀铜乙二胺溶液在校准用粘度计中的流出时间 s 要求 25 的蒸馏水在校准用粘度计中流出时间约为 60 s tKCED tKH2O 1 28 1 29 公 2 12 式 式中 tKH2O 蒸馏水在校准用粘度计中的流出时间 s 2 测定步骤 根据纸样的粘度不同 称取一定量试样 称准至 0 0005 克 于试样溶解 瓶中 加入 2 3 块紫铜片 用移液管吸取 25ml 蒸馏水注入瓶中塞紧瓶塞 剧烈摇荡至试样分散后 再吸取 25ml 铜乙二胺溶液于瓶中 并把全部存留气 体排除 反复剧烈摇荡至试样完全溶解 一般低粘度试样需 3min 即可 调整 溶液湿度至 25 仔细倒出溶液于测定用粘度计中 开动自动循环保温的恒 温器 恒温 5min 测定 25 1 的流出时间 用秒表计时 平行测定三 次 取其平均值计时相对粘度 3 结果计算 相对粘度 r r hn tn 公 2 13 式 式中 hn 校准时测得的测定用粘度计常数 s 1 tn 试样溶液的流出时间 s 1 特性粘度 由 r值即可在表 6 中查出 此表有马丁方程式计算而得 并由 样品质量和溶液体积 50 0ml 计算出浆浓 被 除得到特性粘 度 ml g 聚合度 DP DP0 905 0 75 即可计算出纸浆的平均聚合度 当 1100ml g 时 允许误差 2 700ml g 时 要求误差 1 1100ml g 时 允许较大的误差 纤维素溶于铜乙二胺溶于的反应如下 2C6H10O5 2 Cu en 2 OH 2 C6H8O5 2Cu Cu en 2 2 en 4H2O 上述反应式中 en 代表乙二胺分子 即为 NH2CH2CH2NH2 2 4 3 纸张白度的测定 裁取纸样的白色无墨 无污物的部分 大小必须要能盖住直径为 5cm 的 圆孔 使用 WSB 白度计测定纸张白度 用白度为 78 3 的白板校正白度计 用纸样盖住白度计的测定圆孔 周围不能漏光 测定白度 每个纸样至少选 取三个点测定 取平均值 第三章 结果与讨论 3 1 纸张酶解液中还原糖的测定 3 1 1 纤维素酶的活性测定 纤维素酶是多组分复合酶 不同来源的纤维素酶其组成及各组分比例有 较大差异 同时纤维素酶作用的底物也比较复杂 致使纤维素酶活力的测定 方法很多 且方法复杂而不统一 19 常用的方法有 CMC 糖化力法 CMC 液 化力法 滤纸糖化力法 滤纸崩溃法和棉花糖化力法等 方法的多样化造成 不同产品 不同结果之间无法相互比较的局面 在上述测定方法中 CMC 糖 化力法主要代表外切 1 4 葡聚糖苷酶和内切酶的活力总和 应用比较普 遍 20 因此本文选取 CMC 为底物 21 测定纤维素酶活力 计算结果如表 3 1 所 示 表 3 1 纤维素酶活力测定的计算表 123 平均值葡萄糖量 g 0 0620 0680 0680 066152 4 纤维素酶活力 152 4 200 0 1 20 1000 15 24 U 3 1 2 纤维素酶反应时间的测定 在确定了实验反应的部分条件后 试用浓度为 50mg 100ml 的纤维素酶液 进行时间测定 实验设计的反应时间的梯度为 0 5 小时 1 小时 1 5 小时 2 小时 2 5 小时 和 4 小时 在每个梯度下分别用 1 克绝干纸样以 DNS 法测 定还原糖 选用 75g 双面铜版纸 取 2007 年 3 月 辽宁警专学报 双月刊纸 样 图 3 1 纤维素酶随时间变化曲线 通过图 3 1 可以看到 随着反应时间的增长 1 克绝干纸样被纤维素酶 分解所生成的葡萄糖的量不断增加 当反应时间为 1h 左右时 纤维素酶的效 率出现明显的下降 新生成的葡萄糖的量减少 所以此纤维素酶的最适反应 时间应该在 1h 1 5h 之间 实验采用 1h 作为纤维素酶水解反应的反应时间 在这一时间点上 纤维素酶保持高效性 3 1 3 纤维素酶浓度与底物的比例关系 在已经确定了上述反应条件的情况下 对酶反应的浓度进行探讨 本实 验设计的酶浓度梯度为 15mg 100ml 25mg 100ml 40mg 100ml 50mg 100ml 和 75mg 100ml 在每个梯度下分别用 1 克绝干纸样加入 40ml 浓度为 50mg 100ml 的纤维素酶液以 DNS 法测定还原糖 选用 75g 双面铜版纸 取 2007 年 3 月 辽宁警专学报 双月刊纸样 从图 3 2 可以看出 随着纤维素酶浓度的增大 底物量不变 在酶浓度 为 40mg 100ml 之前反应变化明显 新生成的葡萄糖的量增加很快 在酶浓度 为 50mg 100ml 之后反应变化趋于平缓 新生成的葡萄糖的量增加缓慢 所以 实验选取酶浓度为 50mg 100ml 和 75mg 100ml 为用酶浓度 使纤维素酶与纸 张中纤维素的水解反应近可能的接近反应终点 观察生成的还原糖量的变化 趋势 图 3 2 纤维素酶浓度与底物的比例关系曲线 3 1