生化线性分析.docx

前面写过“生化分析仪维修有关的基础知识”（/forum.php?mod=viewthread&tid=38682），那是针对维修人员的基础培训，而应用问题也是生化分析仪日常工作中的老大难，甚至可以说头疼的问题。所以本帖就以方法及参数有关的知识简略概述一下：1、导向知识：生化分析仪的基本原理是分光光度计，或者俗称比色计。分光光度计的依据是“朗伯比尔定律”。朗伯比尔定律阐述了液体吸光度与液体浓度的关系，并且引申出相应的公式及推导公式。吸光度越高，溶液的色度也就越深，反之越浅。当然前提是同波长下。一般来说，生化反应把吸光度增加的叫做正反应，或者叫做上升反应，色度越来越深；吸光度下降的反应叫做负反应或者下降反应，色度越来越浅。应用和维修的界限其实很难划分，一般来说操作问题属于应用，故障属于维修。但结果问题有可能是应用问题，也有可能是故障，所以生化仪区分应用和维修我认为纯属找麻烦。2、生化的测试方法：从分光光度计的方法来说，有透射和散射两种方法，生化仪只用到透射法，因为它只有一套光路。贝克曼的自有机型和特定蛋白仪及免疫类血凝类设备，还增加有散射法等等。生化的测试方法只有两种，那就是终点法和速率法，其余方法都是衍生法。而单试剂或者双试剂与否与方法关系不大，只跟衍生法有关。不过单试剂的大多是终点法，没见过有单试剂速率法的。2.1终点法顾名思义，在反应终点进行吸光度测定的方法，其衍生方法有一点终点法，对应单试剂；两点终点法对应双试剂。还有一些相关的概念：试剂空白、血清空白。先声明一下，下面出现的所有例图都是选自日立、奥林巴斯、东芝、拜耳这些生化仪的手册，选择的目的一是有代表性，而是清晰度好，并非我个人有所倾向。2.2一点终点法：也就是单试剂采用的方法。这是奥林巴斯的曲线示意图，它是R1+S方式，所有生化仪都是以样本S的加入为正式读点的开始，之前加入的试剂读点都为0或负数。所有试剂和样本加入后，都进行搅拌。上图中R1加入搅拌后进行第一个读点吸光度测试，读点编号为0，然后加入样本再次搅拌开始正式读点1-27。而测试读点是27，也就是反应终点。当然，不一定非要到最后一个读点，很多蛋白反应速度很快，几分钟就到达终点，所以根据情况设置。奥林巴斯的机型算是一类机型，与贝克曼自有机型类似，R和S间隔读点，也正是这个特性引发了试剂空白和血清空白的应用。而日立的机器代表着另一类机型，那就是S+R方式，但S和R在同一圈内加入，所以读点从1开始，没有0也没有负数。如下图：从上图可以看出，第一点已经开始反应了，没有奥林巴斯机型那样有个平坦的水平线。这个图例反应时间比较长，直到30以后才趋于平稳反应终结，所以读点算在了33-34点。也就是最后两点。上面两例都是一点终点法，日立的机型无话可说，它就没有平坦区域，那么奥林巴斯的呢？是否可以在平坦区域，也就是R加入后去一个读点，将空白扣除掉，这样结果不是更精确吗？话可以这么说，事情不能这么做，因为一点终点法都是以反应终结的吸光度为准的，不能出来第二个点，何况机型不同，有的你就出不来第一点。那么在上面两张图里，大家都看到，反应的起点都不是Y轴的0点，可能大于0也可能小于0，单纯的终点吸光度减去起点吸光度仅能适用于一点终点法。所以奥林巴斯机型把R加入后的平坦区域，叫做试剂空白，这没错，这段区域只有R参与，根本没有任何样本。但它并不在测试时增加一个空白读点，而是在测试准备或定标准备前增加了一个试剂空白测试。试剂空白检测完毕后，数据保存在数据库里，在更换试剂之前，试剂到期之前都采用这个数据作为空白值参与结果的计算。试剂空白有一定的范围，超过这个设定范围会认为试剂失效或者污染，所以在奥林巴斯的机型里，试剂空白是一定要做的，而且间隔时间不能太长，否则会报错。除了试剂空白外，还有血清空白，因为血清的底色甚至高于试剂底色。所以在一点终点法中，为了得到精确的结果，也要进行血清空白的测试。要注意的是，这个方法很少使用，因为要测定血清空白需要单独的通道。也就是说一个样本要被测试两次，一次是常规的反应，加入R进行测试，另一次是单独采集样本，不加入试剂，而加入生理盐水或纯水稀释到前一次的稀释比例，单独测试样本血清的吸光度。然后将终点反应的吸光度减去血清空白，得到的结果才是反应结果。如下图：2.3两点终点法，也就是双试剂常用的终点法。在奥林巴斯机型中，双试剂会出现两个或三个平坦的区域，R1加入之后，和S加入之后，如果是终点法，会在反应终点还会出现一个。如下图：那么两点终点法除了在27点读一个之外，还要在10点读一个点，也就是在R2加入之前读一个点。这样反应吸光度值就等于终点吸光度值减去试剂样本空白，注意是试剂样本空白，不是试剂空白，所以这个点只能在S之后，R2之前。惯例一般在R2之前的一个点，而不是R2之前S之后的任意点。下面是日立的图例：由于是S+R1，所以曲线开始就进行反应，除去杂质消除干扰，直到R2加入前趋于稳定。16点之后加入R2，正式反应启动，直到27点趋于稳定，所以终点读点选在33-34上。而试剂样本空白选择在15-16上。从日立的图上我们可以看出，如果选择一点终点法，那么反应的吸光度值应该是137-（-562）=699，而去除试剂样本空白的两点终点法的反应吸光度值呢？应该是137-（-477）=614，可以看出后者更为精确。说明：如果是正反应，吸光度值等于终点值-试剂样本空白值；如果是负反应，吸光度值等于终点值-（-试剂样本空白值）。这就是为什么要告诉反应方向的原因，否则算出来是负的结果没法报了。总结：一点终点法适用于单试剂，两点终点法适用于双试剂，但第一点要在R2之前的一点。2.4速率法：使用最小平方法计算两点间的吸光度变化，确定每分钟吸光度的变化率，也就是OD/min。常规的速率法是在R2加入之后，给出两个读点，系统根据两点间的时间，自动计算每分钟的吸光度变化。下图是奥林巴斯的图例：下图是日立的图例：可以看出上图读点范围是22-28点。采用常规速率法有个前提，那就是R1加入之后前期反应趋于稳定，比较平坦，加入R2之后迅速启动反应，形成斜线，读点范围取在斜线上。如果R1加入之后也是斜线，那就要使用双速率法，也就是在试剂样本空白的斜线上取一段进行空白速率计算。双速率法很少使用，与常规速率法的结果比较差别也不是很大。在日立机型中，常规速率法叫速率A法。日立多了一个速率B法，那是双项目检测的，没有专用试剂无法实现。图例中的速率法每点线性都很好，但遇到每点线性不好的，就会报错，结果被拒绝、屏蔽。线性不好一方面是试剂质量问题，另一方面是反应特征，无法保持线性。那么这种问题各个厂家也都有对应，日立叫做两点速率法，奥林巴斯叫做固定点法。2.5 两点速率（固定点）法：确定特定两点间的吸光度差值，无线性甄别。还有引申出来的双固定点法，对应双速率法：上面两图都是奥林巴斯的，下面是日立的两点速率法。2.6 终点法和速率法的运用不能混淆，什么项目用什么方法一般不会有错，试剂厂家的说明书上都有明确介绍，一般不会搞错，但也有例外，下图就是一个例子，是小东版主的讲义节选的。例1：故障现象是TBA结果总是出现负值，而且更换过试剂，定标都通过，仍然解决不了。曲线如下：方法采用的是两点终点法（R2之前之后各一点），这是致命的错误。根本找不到终点的曲线，怎么能使用终点法呢？再来看看负值是怎么来的，TBA是正反应，如果采用两点终点法应该是后点-前点。左图后点高于前点，所以是正值；而右图后点低于前点，减出来肯定是负值。但方法错误这个前提已经确定，后面再怎么分析也没有意义了，明显的速率法。读点问题最常见，这也就是结果问题要找曲线的原因所在。例2：这是群里的一个问题：高低密项目定标和质控都没有问题，就是病人结果偏低。这个无法直接回答，还是上曲线看看吧。两张图传完就明白原因了，读点错误。高低密采用两点终点法，而两点终点法的关键是R2之前一点，另一点在反应的终点。而图上明显是两点都在R2之后，再分析为什么会结果偏低，以第一张图为例。这个机器是R1+S方式，R1加入后吸光度在400上下，比较平稳，紧接着加入S，吸光度升到1000左右，加入R2之后，反应终点区域大致在1300左右。如果是R2之前一点为1000，R2之后反应终点为1300，那么两点终点法的反应吸光度为1300-1000=300，据此计算浓度。而图例中两点都选择在了R2之后，第一点的吸光度大致在1300左右，第二点也是1300左右，二者相减相差无几，搞不好还是负的，难怪结果低了。有一点我很不理解，生化仪的软件设计人性化方面有问题。既然选择了终点法，你就不该让操作人员设置读点的时候把第一点设为R2之后，干脆报错提示多好呢？2.7 速率法的底物过剩问题。所谓底物过剩，就是样本浓度太高，试剂提供的反应物质迅速反应完，而样本中的检测物质还有很多没有参与反应。通俗的话讲，就是在速率法的反应中看到了终点法的曲线。下面是图例，也是小东版主的讲义：图例中看到的是典型的日立速率A法，见到这样的图，结果肯定偏低甚至为0或者负值。这样的图首先应该想到方法是不是错误，如果速率法没错，那就只有一个可能，底物过剩。几乎所有的机型都提供危急值报警和自动重测，遇到这种情况，一般都采取自动或人工稀释重测的方法解决。而东芝及其OEM机型雅培的生化仪，还有日电及拜耳的机型，可以自动进行判别，并将读点前移。东芝叫做弹性速率法，日电叫做读点前移。概念是这样的：以上右图为例，速率法选择的主读点区为22-28，并加以吸光度判别和线性判别，当出现底物过剩时，这个主读点区的线性几乎停滞，吸光度变化降低到几乎为0，这种情况下启动弹性速率读点区，一般设置在R2加入后10点以内，比如选择在17-21这个区间里。在弹性速率区间里进行速率法计算，从而得出一个较高的浓度值，因为这一区间反应速度很快。这种方法以前有很多医院的老师作过实验并发表过论文，与手工稀释的结果比对，符合率高达96%。这样一来，省工省力，节省了医院最为看重的成本。下图是官方的弹性速率解释和读点前移介绍：总结：终点法记住关键的R2前的一点，速率法的读点都在R2之后，两点速率法或固定点法不检查线性，底物过剩要看曲线。3、生化的定标方法：定标方法分为线性定标和非线性定标，也就是俗话说的直线定标和曲线定标。生化中大部分项目都是用线性定标，而非线性定标大多用在免疫比浊项目上。3.1 线性定标。我们都知道，两点决定一线，所以要定标最少要有2个定标点。定标的概念是在直角坐标系中，以浓度为X轴，吸光度值为Y轴，通过校准点的XY轴对应关系，将直线确定下来，标本测试中所有的吸光度值都能在这条直线上找到对应的浓度值。如下图所示：图中给出的STD1、2两点是定标液，无论它们的吸光度值是多少，都会有一个确定的浓度值赋于它们，那么在直角坐标系中，这条定标曲线就被确定下来，无论样本的吸光度值是多少，都能在这条线上找到对应的浓度值。同时我们还能看出，这条直线是这个第一象限的角平分线，也就是45度的倾角。这种定标的结果保证了很宽的线性范围，无论多高多低都会有良好的线性。如果这个倾角大于或小于45度，那么在宽泛的测试中，吸光度的变化与浓度的对应就不能好计算了。所以很多高值或低值结果不好，而且又是线性定标的话，就要看看定标曲线是不是45度的倾角，如果不是，就要考虑定标问题了。那么定标的直线是怎么来的呢？根据直线方程而来，也就是一元一次方程，Y=AX+B。Y是吸光度值，X是浓度值，A是因数，B是截距。因数也被称为斜率、K值。再通俗的讲，A其实就是这条直线的倾角，B是X=0的值，也就是直线与Y轴的交点。所以得到这条直线的方法有三种：I、假设直线过原点，也就是B=0，那么只要给出A的值，直线也就可以得出。当然如果要想得到45度的漂亮曲线，至于要将A=1即可，也就是Y=X。这个A大部分时候要乘以10000，这是一个换算因素。也就是很多厂家给出的K值是1万多，8千多等等的原因。这就是常说的K因数线性定标法。II、假设直线过原点，也就是B=0，那么只要有一个非零点的值，就可以得到整条值线。因为第一个值已经确定，那就是Y和X都是0，也就是原点。这就是常说的一点线性定标。III、给出两个定标点，让机器自己计算直线是否过原点，这就是两点线性定标。我们可以看出三种方法前两种都有一个前提，那就是假设直线过原点。那么到底这个项目是否过原点呢？我们并不肯定，所以I、II两种方法都有缺陷，不太靠谱。特别是I种方法，无法得知厂家给出的K值是怎么来的，如何界定准确与否。下图是因数K值定标和假设过原点的一点线性定标示意图：所以推荐的方法，也是不出错的，最为准确的方法是III，两点线性定标。在两点线性定标中，大多数时候是给一个标准点和水点，水点的意义是给一个零浓度的点。这样一个零浓度，一个有浓度，两个点决定一条直线。当然，零浓度点也可以用带有浓度值的标准替代，无论如何只要给两点就能决定一条直线。下图就是示意图：K因数法定标虽然不靠谱，但大多数医院特别是小医院还是喜欢用，因为毫无成本，不需要校准品。但也正是因为这样的不靠谱，导致所有采用这种方法校准的项目，结果往往出现高值不高，低值不低，甚至与其它机器无法做出准确的对比。假设过原点的定标又叫一点线性定标，只需要一个校准品即可。但有一个问题，你确信它绝对过原点？如果不过原点，那么就存在一个截距，结果总是差那么多，又不能改系数，非常别扭。在日立机型上，三种线性定标的方法分别称为1点定标（K因数法），两点定标。东芝和拜耳与之类似。在奥林巴斯的机器上ACAL AA法针对的是两点线性定标，给出两个浓度点（其中一个可以是零浓度）自动进行直线矫正，自动判断是否过原点。而ACAL AB则是假定过原点，再给出一个浓度点即可，也就是一点线性定标。MCAL MB法则是K因数法。奥林巴斯经常出现结果不准的问题，很大程度上与定标方法的选择有关，大部分都选择ACAL AB或者干脆使用MCAL MB。抛开K因数法的MCAL MB，单说ACAL AB。其实我们无法得知这个项目或者这个试剂是否真的过原点，是否总是过原点，因此ACAL AA是最佳的选择，因为并不增加成本，只是给一个水点，也就是零浓度点罢了。由于奥林巴斯机型软硬件设计上的特点，把简单的定标搞的云山雾罩的，特别是几种颜色的架子，把人们搞糊涂了。而且很多人把试剂空白和水点混为一谈，造成定标方面的诸多问题。试剂空白是奥林巴斯机型必须要做的，为了保证结果的准确，在测试吸光度上减去试剂空白是正确的。而试剂空白并不是零浓度点，两个完全不同的概念。试剂空白是各个测试都要参与的，零浓度点只在定标时使用。虽然二者使用的样本都是水。奥林巴斯机型中，蓝色架子是试剂空白，这个在测试前要先放入进样器，紧跟着是定标用的黄色架子。我们一般都采用多项目定标液，一瓶定标液可以定标多达20几个项目，这20几个项目用这一瓶定标液就可以搞定了。当然多点定标的免疫比浊项目不行，是单独的定标液。黄色架子的第一个位置要放纯水，告诉电脑这是零浓度点，也就是第一定标液。第二个位置才放多项目定标液，告诉电脑不同的项目的值是多少。其后才是放置质控品的绿色架子和常规样本的白色架子。很多时候由于定标液太多，特别是开了不少多点定标的项目，一个黄色架子排不完。那就多排几个黄架子，如果没有，就一个黄架子，那就多走几遍。第一个黄架子之后跟着第一个黄架子有关的质控绿架子，然后测试，就不要放白架子了。这一遍走完，把没有做的定标液换上，再跟与之有关的质控绿架子，再来一遍，直到定标和质控完全走完再走常规样本。很多定标问题都出现黄架子的第一个位置是定标液，根本没有水点，理由是前面的兰架子做了试剂空白了啊？！这是典型的误区。还有的不放水点的原因是黄架子位置不够了，没法做。这是不是理由的理由，搬家一次搬不完不会分两次啊，一口吃成胖子不成？总结：线性定标最好选择两点，其中可以包括水点（零浓度点），坚决摈弃K因数法。3.2 多点线性定标：很少用，我也不知道什么项目会用到。两点决定一线了，还要那么多点干吗呢？只知道同工酶法是多点线性，但如何应用并不清楚。不过存在必有道理，我孤陋寡闻罢了。3.3 非线性定标。针对线性定标的直线来说，非线性定标肯定是曲线，曲线的趋势不同，决定了不同的结果走向。非线性定标最少需要2个点，但一般最少选择4个点，否则曲线难看不说，结果也做不好。非线性定标大致分为对数（logit）曲线，折线（polygonal），指数（exponet）曲线和样条（spline）曲线。下图是对数曲线下图是样条曲线：下图是折线下图是指数曲线折线和指数曲线很少使用，我还没在应用中见到过用这两种曲线的定标项目。奥林巴斯和拜耳把所有的非线性定标都认作是多点定标，至于曲线趋势根本不管你是对数还是样条，只要你给我定标点，我就给你画出来，然后再定标曲线上查找对应的值。但奥林巴斯的多点定标又有ACAL和MCAL之分。ACAL n（2-7）AB是自动进行多点定标，最少要有2个点。但这个软件人机对话方面有些问题，按理说按照日立的设计，多点定标分那么种，你都给罗列上不就行了吗？不，奥林巴斯分了两步进行输入，首先输入定标类型，也就是多点定标还是单点定标，线性还是非线性，自动还是人工。然后在后面紧跟着一个公式选择，让你选择计算公式是直线方程还是对数、折线、样条等等方法。这下把操作人员又搞糊涂了。上图是多点定标的曲线，看起来也是对数曲线，下图是定标设置的参数屏幕前面的红圈是选择定标方式的，多点定标的话最少要选择2AB以上，图上是5AB，也就是5个定标点。后面的红框是选择计算公式的，图上选择的是折线（polygonal），但是很明显，CRP用折线很不合适。前面的定标点选择也就是定标方法选择很少出现问题，有几个定标液大家都知道，往往是后者公式选择错误，造成定标质控还可，结果一塌糊涂，特别是高低值的标本。我还真记不住公式里面都有什么，记得有直线方程，折线，样条，对数和指数。再看上图，CRP的5个定标点没有水点，也就是说没有零浓度点，那么系统会默认从原点开始。这就是很多人做出来的非线性曲线在最低浓度处会出现一个怪异的扭曲的原因。而奥林巴斯的MCAL n（1-7）MB是人工多点定标，与自动多点定标的区别是人工多点定标认为是折线，每一个线段都有一个斜率，做不出曲线来。所以这一点也要注意。对数曲线大家都很数学，中学学习对数的时候没少折腾，俗称抛物线。日立和东芝把对数曲线分的很细，有LOGIT-LOG3P/4P/5P等，分别代表不同的对数趋势，所用的定标点都一样，2-6个。Log3P的趋势图Log4P的趋势图Log5P的趋势图从这里可以看出不同的Log趋势，对相应高低浓度的吸光度对应有着不同的对应，所以在方法没有错误的情况下，结果高值不高，低值不低，甚至相反的时候，可以在这些机型中找到对应的曲线趋势进行重新定标。有人说只要是多点定标就采用样条Spline，这仅仅是大多数而已，也有特例的。对数与样条曲线的差异还是很明显的。一般来说，除非厂家明确给出定标方法，如果没有给出，多点定标先选择样条曲线进行定标，定标后观察曲线，人工判读是折线好，还是对数好，还是就是样条。对数的话还要看是哪一种对数。要有一个人工判读修改的过程，不能什么都交给机器，机器毕竟是死的，你告诉它什么，它就认为是什么。多点定标中，理论上讲应该倍比稀释，也就是说厂家发来一瓶定标液，要倍比稀释5份，加上一份水点，按照浓度从低到高的顺序加入测试进行定标。这也是最经济的办法，毕竟一瓶定标液的价钱在哪儿摆着。例如一瓶标有浓度为40的定标液，倍比稀释加上水点后的浓度依次为0、2.5、5、10、20、40(0、1/16、1/8、1/4、1/2、1)，这样做的定标方法可以直接选择样条曲线。但也有很多厂家给出了五种定值的校准品，而且并非倍比的。相邻定标值不是两倍关系，甚至多达几十倍的关系，这样做的目的无非是要拉宽测试结果范围，能做出很高的值来。但是这样一来，超高值的可靠性就很令人怀疑，而且肯定做不准的。我听到过很多人对此的解释是反正已经超高了，准不准的意义不大。唉，这也是国情所在，毫无办法。老老实实做事的，被冠以结果范围太窄，稍微一高就做不出来，要人工稀释才行。而这些用这种方法做出来的，根本无人管结果准不准，只要是能减轻他的工作强度就行。如果采用了多种定值校准品，而且不是倍比关系的，就不能采用样条方式，在对数曲线里找一种合适的吧，或者看看指数函数是否适用。一味拉高定标值也源自机器设置，超过定标最高值，就不出结果，提示超过定标值，这样引起操作人员的不满。唉，稀释啊，都有LIS，稀释后传到LIS上，在LIS上修改一下结果。但这会加重操作人员的负担，哪怕是计算器算一下，手工稀释一下，再做几遍的时间。一般遇到多种定值校准品校准后结果出现问题的，我都要求用最高值倍比稀释重新定标，方法还是采用样条曲线。而且多次试验证明，用最高值倍比稀释后，再重测其它四种定标液，得出的数值有的相差甚远，厂家当初给的值就不准，怎么能保证结果的准确呢？总结：多点定标别忘了水点，倍比稀释才能保证结果准确，在无法判定方法的情况下，先采用样条曲线，然后人工判读修改。3.4 在定标中，有很多检查需要注意。如空白吸光度，每一点的吸光度范围检查，线性检查，灵敏度检查等等，如果设置了这些检查，那么超过这些检查值就会报错，定标不会通过。同样，通过了这些检查的定标肯定是值得信赖的。如果不想进行检查，要想定标顺利通过，那最好取消或者将这些值放到最大。这样做定标虽然会通过，但准确性大打折扣，自己心里都没有底儿。定标后的校正问题：定标后特别是多点定标后，对曲线不满意，或者样本结果不满意，可以采取重新定标（也叫全点校正）或者单点多点校正方式修正定标曲线。通俗的讲就是取其中一个点或一两个点进行定标，从而修正整条曲线的方法。采取这种情况，一般是多点定标液的一种或几种用完了，或者只有其中的一两种的情况下。除非必要，否则真的没理由采取这种方式。下面的图示是奥林巴斯的单点校正示意图下图是东芝的单点和两点校正示意图说白了，就是根据原来的曲线趋势，任意改变其中的一点或两点，自动进行其余点的浓度计算，从而修正整个曲线。我有个朋友是做应用的，他最喜欢干的事情是做单点或两点校正，认为这样省事省力。但经常出现结果还不如从前呢。于是乎我下班回家做饭，这位老兄下班呢到我家吃饭，然后就写写画画，分析今天的单点校正为什么不行，昨天的两点校正为什么那么怪异。我的反应一向很慢，在数据不充分，没有查询的情况我很难得出一个令我自己信服的结论。我信奉一个原则，那就是省事儿就是费事。所以我从不做单点或两点校正，而是全点重新定标。每次看到老兄给我的曲线及后面的校正图后，都能找到相应的校正点，而不是他选择的。也就是说出问题的点不是他修正的那个点。这个判断很难描述，特别是在没有案例曲线的情况下。这位老兄也云山雾罩，死活不理解我的判断。后来，大概半年后，这位朋友彻底抛弃了单点或多点校正的方法，改为老老实实的全点定标，真正的省事省力了。本主题由 郑振寰 于 2014-6-19 15:44 加入精华窗体顶端post_newreply窗体底端分享到:QQ好友和群QQ空间腾讯微博腾讯朋友收藏12分享微信看贴要回是本分,有问必答是人才,解决问题回贴是公德.医疗设备维修.维修咨询(请尽可能在论坛提问),协助维修,上门服务.电话复举报沙发楼主|郑振寰发表于 2014-3-13 22:31|只看该作者4、新上项目:在新开展项目之前，需要进行参数的设置。而在参数设置之前要做下列准备工作：a、准备试剂、校准品（定标液）和相应的质控；b、准备微量样本杯，分配校准品和质控品；c、准备试剂说明书、相应的上机参数；d、翻看仪器的操作说明，登记项目、试剂及校准品的名称、位置、容量、有效期等信息。e、参数录入f、进行校准和质控，判断校准数据、校准曲线和反应曲线是否符合反应趋势，进而修正参数的部分细节。判断质控是否在控。g、样本测试，进行重复性验证和线性验证。4.1准备试剂、校准品和相应的质控：如果对溯源要求很高，那当然是封闭型设备的原厂试剂原厂质控校准品，省心省力。而第三方试剂、校准、质控，也能溯源，只不过麻烦些而已。很多医院增设新项目，选择第三方试剂的原因就是考虑成本问题。最怕的是试剂、校准、质控是三个不同厂家的，不用说溯源，就是保证结果都不容易。一般的组合是试剂厂家提供试剂和校准品，采用第三方质控；或者试剂厂家只提供试剂，校准品和质控品为另一个厂家，比如朗道的，这样会多少好一些。准备的试剂、校准品和质控品一定都要有效期内，而且是未开封未复溶的产品。已经开封使用过的，暴露在阳光下常温下不知道多久的，最好别用，说不清楚。质控和校准品一般都是干粉的，先复溶使用。很多医院把校准品和质控品复溶后分装使用，这在新上项目上最好别这么做，不能处处都说不清楚，能说清楚的还是说清楚。4.2 准备微量样本杯，用来分配校准品和质控品准备上机使用，尽量不要使用子弹头离心管。很多采用离心管的，造成撞针情况的不少。因为校准品和质控品是当做样本，放入样本盘或样本架上的，大部分机型能自动扫描并识别样本类型，是试管还是样本杯，这样就会指导样本针下降高度和判断液面的开始时间。而离心管无法直接放到样本盘架上，只能插入试管上，让试管当托架，这就容易造成误判。机器认为是试管，那么就会按照试管的标准指导样本针下降，并按照试管的液面探测时间开启探测，结果因为离心管的存在，导致行程根本没有那么大，液面探测还没有开启就已经撞针了。严重的会导致样本针弯曲折断，还有的会扎漏离心管，让人惊心动魄。当然，有些机型的某些设计是允许离心管直接放入的，比如东芝的TBA120FR，它的C/C盘就可以直接放置1.5ml的离心管。但要注意，能够直接放置离心管的机型，一定要把盖子去掉，否则盖子回弹，一样会撞针。4.3准备试剂说明书、相应的上机参数：每个试剂盒里都有试剂说明书，里面涵盖了很多内容，包括：名称、规格、用途、成本、有效期及存储条件、适用机型、样本要求及方法。除此之外还有性能指标、注意事项等等，当然还有最为重要的注册证号、标准号、厂家及联系方式。在使用方法里面，会告诉你波长选择、方法及方向，然后是试剂配比的操作方法。要注意的是，这里给出的试剂配比是指手工法的，配比之后上分光光度计读数，然后根据后面给出的公式自行计算的方法，并非上机参数。按照这个配比比例，根据不同机型的反应杯最小和最大反应容量可以自行按照比例计算上机参数的试剂量和样本量。几乎每个试剂厂家都提供不同机型的上机参数，当然也有例外，那就是新出的机型，或占有率较少的机型，厂家还来不及准备。上机参数比较直接，对应机型和项目，直接录入进去就行了。下面举一个例子，厂家就不提供了，只是说明问题：项目名称为TBA，也就是总胆汁酸。厂家的说明书部分截图如下：前后都有省略，说明问题罢了。由这张说明书上，我们可以看到TBA的方法是速率法，递增（上升）反应。主波长为405nm，副波长为660nm。样本量为20ul，R1量为1350ul，R2量为450ul。不仅有样本的配比，还有标准品的配比，当然二者一样，除此之外还有空白的配比。手工法空白要单独做，用蒸馏水替代样本，测试的是试剂空白。这在很多的机型中自动完成。而在这个厂家的上机参数里，是这样描述的，机型是TBA120FR：这并不是现在我们看到的TBA120FR的界面，而是老式的，并且没有分页，直接罗列。所以在输入的时候，对应英文选择性输入。首先我们看到手工法和自动法的试剂配比关系，也就是试剂说明书和上机参数之间的关系。说明书的配比关系是：样本量为20ul，R1量为1350ul，R2量为450ul，上机参数的配比关系是样本量为3ul，R1量为200ul，R2量为66ul，几乎就是20:3的关系。所以只要按照比例关系，几乎可以任意设置。那么反应杯的反应总量上下限与试剂配比的关系是什么呢？我们都知道，TBA120FR的反应杯反应总量为80-360ul，低于80ul将无法通过光路，高于360ul会出现漫盘。所以常规选择一般是选择最大反应总量的70%-80%之间，也就是250ul-290ul之间。例子中是269ul。很多医院为了节省成本，也很清楚仪器的最低反应量，于是乎把总反应量调整到最低，从而达到节省成本的目的。但往往这么做并不理想，结果很不好。原因有几个方面，仪器给出的最低反应量是在极其理想的情况下得出的，真正使用过程中很难达到这个理想条件，因此在设置最低反应量的时候，要把仪器给出的最低反应量乘以120%-150%，也就是100ul-120ul之间。这一点奥林巴斯比较老实，声称最低反应量为80ul，但要求90ul，由此可见一斑。还有一点就是如果按照比例配比，样本量会很低。还是按照这个例子，把20:3换成20:1，也就是样本量1ul，R1量改为70ul，R2量改为25ul，反应总量为96ul，超过最低反应量80ul很多，理论上应该能够保证准确。但这个世界上应该的事情往往不应该，1ul的加入量已经是极限了，在自动生化仪里，虽然声称加样步进为0.1ul，但没人采用小数量，都是采用正数量，最小也是2ul。如果是1ul，一旦加样系统有问题，比如定量注射器偏差、针尖污染锈蚀等等，很有可能这1ul就加不准，甚至干脆就没加。那么只把试剂量降下来，样本量不变是否可行呢？试想一下，正常反应1ul样本的试剂，加入了3倍的样本，样本浓度稍微高一点就会导致反应不完全，速率法直接出现底物过剩，终点法的曲线会看到速率法的曲线，根本没有终点。得到的结果还是不靠谱。所以理论回归理论，不能一味的节省成本。成本和结果保证之间要有交叉点的，不能是背离的，那样就毫无意义了。接着说这个上机参数，这里的参数给出了读点，主读点是20-26，弹性读点是18-24，这是东芝雅培和拜耳特有的，别的机型没有弹性读点。样本加入量是3ul，重测增量和减量分别是10和5ul，当然要稀释，但上面并没有选择稀释量，所以这个功能就没有作用，也就不自动重测。定标方法选择的是线性，2点定标，并且给出了两个点的浓度，一个是水点，浓度为0，另一个是标准品，浓度*表示标准品标称的数值。除上面以外，所有的检查都没有做，只是选择了TBA的单位，umol/L。这个参数基本上是完整的，可以上机录入使用。4.4翻看仪器的操作说明，登记项目、试剂及校准品的名称、位置、容量、有效期等信息和参数录入：每种仪器操作都不相同，所以说明书还是要看的。一般来说，操作步骤是先注册登记试剂，R1和R2要分别登记注册，包括名称（最好与测试项目重名），试剂位置，容量，报警容量等等相关内容。第二步才是测试参数登记录入，包括测试名称、反应方法及方向、样本和试剂量、反应监测等，而后是正常值范围设置，接下来就是定标液和质控的设置以及定标和质控的反应监测等等。在这里就不出图列举了，每本说明书上都有，站上也有很多资料和帖子介绍。在参数录入的界面里，需要说几句，大部分是 英文，而且很多都是缩写，有时候会搞错。但有个原则，搞不清楚的地方最好默认，不要尝试修改或输入数据。日立机型都差不多，大致如下：添加测试项目界面：详细的分析参数界面注意上面的英文提示，都很清楚。在分析方法和监测时间后面有四个框，一点终点法输入第一个框，后面默认为0；速率法和两点终点法填写前两个，注意两点终点法第一个要输入R3或R2之前的一个点。速率法要写R2或R3之后的两个点。而波长的选择上，副波长在前，主波长在后，更要注意。试剂的选择要注意，试剂容量之后是稀释量，不稀释默认为0，后面跟着的是注册试剂时的试剂编码，一般跟位置号相同，在后面是有效期天数，一般最大为99。吸光度界限检查如果不采用的后，最后放到最大32000，反应方向要选择，不然计算错误甚至报错。前带检查之类的可以放到最大，不检查。日立的试剂参数有些特殊，因为它支持四试剂使用，R1就是第一试剂，这个都可以理解，但R2不是我们常说的R2，并不在5分钟之后加入，而是在1分半也就是5点之后加入，适合用于短程反应，而R3是我们常说的R2，在16点之后，也就是接近5分钟的时候加入，这是常用的方式。所以在日立参数设置的时候，要把R2设置到R3上。R4是在33点之后，也就是10分钟的时候加入，适用长程反应。第二个页框是定标参数：有名称选择，定标方法选择，定标点的数量，量程及加权。量程点一般都是2，加权可以不选择，默认为0，单点校正的时候会有作用。接下来是定标间隔、批号有效期以及定标吸光度检查参数。图上都是默认的，不选择或不检查。第三个页框是正常范围，可以输入不同年龄段和性别的参考值，目前都用LIS，所以这个地方一般都不设置。第四个页框是标准品的参数，标准品都在什么位置，浓度值分别是多少。如果测试项目涉及到特殊的公式计算，就需要在公式界面里添加注册，这样就会得到一个计算项目。当然也有直接在LIS上添加一个计算项目的，在主机上就不用了。上面是日立的参数录入界面，下面是奥林巴斯的：奥林巴斯是分散登记，上图这个界面仅仅是参数，样本试剂量，方法，主副波长，方向，读点及现行检查等等，LIH样本检测很少用，ISE只针对装有ISE的机型，范围呢也都用LIS的，不用管。由于奥林巴斯不支持两种以上的试剂，所以只有R1和R2。但为了进行糖化血红蛋白三试剂的测试，单独设置了一个糖化血红蛋白的测试界面：定标液需要在单独的液面中设置：下面是东芝TBA120FR的试剂登记界面：添加项目界面：下面是Outline窗口，主要是正常值范围危急值范围之类的Base窗口，主要参数录入都在这里，方法方向波长读点试剂样本量等等定标窗口质控窗口.后面还有交叉污染和重测规则窗口。在这里设置定标液和质控浓度之后，还要在相应的界面登记定标液和质控液位置。下面是登记质控：下面是登记定标液：这些界面都在各自的说明书里有详细介绍，所以耐心看手册还是有必要的。4.5 进行校准和质控，判断校准数据、校准曲线和反应曲线是否符合反应趋势，进而修正参数的部分细节。判断质控是否在控。参数设置完成之后，要进行定标和质控以及样本测试，进一步判断设置的是否合理正确。像几乎所有机型，定标之后都会打印一个定标报告，当然把原机配套的针式打印机拆除或者没有纸张，那就打不出来了，而且贝克曼的定标报告很详细也很复杂。而有些机型不打印定标报告，只是告知定标是否通过，有什么错误提示而已。这里只举例日立的定标报告。这是正常的校准报告，都是两点线性定标，第一点都为水点。报告的格式是：TEST S1 S2 S3 S4 S5 S6 （标准液S1-S6）上图都是只用了两个定标液，所以只有S1和S2有数据。每个定标液下面都有左右两列上下两行。左边的列表示主副波长的差，右边的列表示主波长的吸光度值，上下两行表示两次定标结果比对。理论上讲，两次结果应该完全一致或接近，也就是重复性要好。主副波长的差也就是左列应该越小越好，不同试剂和方法有不同的要求。如果出现定标失败，会在定标报告上提示，如下图：第一组TBA的定标，左列值小，重复性也很好，仅仅是因为与上次定标相差了20%而提示，没有关系，重测一次就行了。而第二组GLU，水点左列和右列相差无几，主副波长的差这么大，试剂和水肯定有问题。而标准点也就是S2点，重复性都没有，而且主副波长差竟然比水点还小，只能认为是放反了定标液，或者定标液就没放，因为有样本提示。下图是昨天才在群里提问的：IgG项目，5点定标，可以看出所有点的主副波长差几乎跟主波长吸光度一样，况且日立的机型吸光度范围只有32000，而S4和S5两点已经接近或超过32000了，校准品和试剂问题很大。后来也承认，定标液过期很久了。除了看定标报告，还要注意定标提示借此分析定标失败的原因。大多数情况下要看定标曲线。定标曲线又称工作曲线。这是日立的定标曲线查看界面下面是日立的定标曲线举例：下图是奥林巴斯的定标曲线。下面是东芝TBA120FR的定标曲线界面：在封闭试剂的机器中，很多并不给出定标曲线，也就是说无法查看定标曲线，例如贝克曼的自有机型。从定标曲线可以看出，单点或两点线性定标，接近45度的为最佳，而多点定标，根据选择定标方式，越接近曲线趋势的越好。比如日立图例的两张图中，上图是Log4P，很符合，而下图的Mb选择是样条Spline，咋看起来与Log4P的差别不大，但注意第二点的拐点，如果用Log4P就会不符，所以选择Spline样条是正确的。这也就是为什么要验证或修正的原因。质控测试的目的主要是看是否在控，如果在控可以进行下一步的样本测试，如果失控就要查找原因，及时处理或修改参数。质控测试要查看反应曲线，看看反应曲线是否正确。下图是日立的反应曲线查看界面：下面是奥林巴斯的反应曲线界面：下面是东芝TBA120FR的反应曲线界面：4.6样本测试，进行重复性验证和线性验证：样本测试主要检查反应曲线是否遵循相应的反应规律，曲线是否平滑，有无跳点，线性如何。重复性验证则是通过机器自带的重复性检测功能来验证机器的可靠性。重复性很好的机器，可以通过定标等手段保证结果的准确，但是重复性都保证不了，怎么定标都没用的。线性验证主要是检查试剂在一定的区间内的准确程度，高值、极高值、低值、极低值都能否作准。一般采用极高值标本进行倍比稀释分别测定，测定的结果与计算结果进行比对，依次来验证测试方法、定标方法和试剂性能。4.7 没有上机参数的上机经验：很多操作人员只有试剂说明书，并没有上机参数，如何输入参数调试成为难点。其实只要明白原理就不难解决。前面说过，根据试剂说明书的测试方法，反应方向以及样本和试剂的配比，结合生化仪的操作手册，就可以设置参数了。而读点可能会是一个瓶颈，很多厂家的说明书并不给出读点时间。这个在后面会有说明。根据生化仪操作说明，得知反应杯的最大和最小反应量，根据前面所讲过的配比方法进行计算后，可以确定样本量和试剂量。读点是指反应杯通过光度计的时间间隔，或者说反应盘旋转一圈的时间。说明书都会给出下面的图：这是日立的，从这张图中可以看出日立的机型支持四种试剂，R1-R4。S+R1方式，而且S+R1同圈加入。R2的加入不到两分钟，R3为5分钟加入，一般十分钟反应最后读点为33、34，长程反应到15分钟的49、50点。由于试剂加入时间是死的，无法改变，那么其在哪一时间加入试剂变得不那么重要。大多数试剂说明书要求R1加入后孵育5分钟加入R2，那么上图也给出了R3是5分钟加入，那就把R2设置到R3上就行了。那么日立读点间隔到底是多少呢？说明书给出的是18秒。上图给出的R3是5分钟，读点是17点，300秒除以17点，差不多就是18秒。有了这个参数，在设置读点时就有了办法，两点终点法第一点在R3之前，也就是15-16点，第二点在最后一点，也就是10分钟的33-34点上。注意日立的读点不是一个点，虽然选择的是一个点，但计算的时候是你选择的点和前一个点的吸光度平均值，所以我会写出两个数值，最大的那个数值是输入时的数值。而速率法一定两个点都选择在R3之后，也就是17-34的任意两点。当然要有一定的间隔，不能过近。而且也不能太接近R3的17点。不过这个不重要，随便设一个，比如22-28，设完之后做测试，观察反应曲线，必要的时候修改参数到反应曲线斜线的最佳线段处即可。这是奥林巴斯的，简单明了。这张图可以看出奥林巴斯只支持2个试剂，也就是R1和R2，而且是R1+S方式。R2的加入时间是P11，也就是12点，而反应时间只有3分27秒，那么一个读点就是差不多18秒。R2之后的反应是5分6秒，总反应时间只有8分33秒，没有长程短程之说。那么有人就说了，我的试剂说明书上要求R1孵育要5分钟，它只有3分半怎么办？没办法，人家就这么设计的，就3分半吧。不过有些反应曲线R1加入后没有稳定趋势，这就说明R1 的量少了，应该适当增加。很多人设置参数照搬日立或东芝的到奥林巴斯上，其实要考虑R1的孵育时间短的问题。比如下图：这是东芝雅培的，也是双试剂，9.6分钟33个点，每个点也就是18秒，16点之后加入R2，R1孵育时间是5.1分，R2反应时间只有4.8分，大差不差，跟日立类似。读点选择之后，将所有的检查都放到最大，也就是不检查，那么基本参数就设定完毕了。接下来设置定标和质控。定标前面都讲过该用什么方法，定标注册，位置指定，浓度指定等等。质控就设置一个浓度和位置，很简单。有人说了，我既没有日立东芝奥林巴斯的图，也不知道机器的读点间隔，更不知道R2什么时候加入，怎么办？不要紧，也有办法，麻烦点儿就是。遇到这种情况，直接在参数界面输入方法，主副波长，反应方向，试剂样本配比，这些都在试剂说明书上，不要告诉我没有试剂说明书，你这试剂捡来的不成？测定方法都不确定的话，先选择终点法，而且是一点终点法。至于定标就选择一点定标或因数定标，设定完成后直接进行定标和样本测试，无需经过质控过程。无论定标是否通过，都能看到定标的反应曲线（不是定标曲线）或者样本的反应曲线，根据反应曲线判读分析，确定到底采用何种方法，读点应该如何选择。还是用最前面的那个设置错误的例子来从这个图上看出是R1+S方式，R1在0点加入，S在10点之后，大概是11点加入，R2在15点之后，大概在16点加入。整个反应曲线是终点法的特性，所以在选择两点终点法的时候，第一点应该是15点，第二点应该是30点之后的一个点。按照此思路修改参数，再次测试，看