脲酶活性的测定.doc

大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.050.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于300.5水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。空白试验：不加尿素，其他同上。品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。 0-1min变红，活性非常强（1.0）； 1-2min变红，活性大概0.5-1.0； 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。如果红斑面积多于20%，则认为该样品脲酶活性超标，为不合格产品。四、注意事项：1.对于样品较粗、具有大块状的样品，最好将其稍微粉碎，亦不可太细，否则不容易观察；2.样品一定要铺平，容易观察；3.溶液保质期为3个月，最好1个月内用完；4.此方法容易受颗粒度影响。定量法：滴定法一、原理：在300.5下精确保温30min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应，用过量盐酸中和所产生的氨，再用KOH标准溶液回滴，以每克大豆制品每分钟分解尿素所释放的氨态氮的含量来表示脲酶活性的大小。二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不应产生大量热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；碱式滴定管；尿素-磷酸盐缓冲液：溶液3.403g磷酸二氢钾于约100ml新蒸馏水，溶解4.335g磷酸氢二钾于约100ml新蒸馏水，然后将；两种溶液合并配成1L，其pH应为7.0。再将30g尿素溶解于此缓冲溶液中，有效期一个月（现配现用）；盐酸溶液：0.1mol/L；氢氧化钾溶液：0.1mol/L；混合指示剂；三、方法：样品粉碎，并且全部过200um样品筛。（粉碎时不可产热）称取0.2g（准确至0.0002g）样品于纳式比色管中，加10ml尿素缓冲液，立即盖好剧烈振摇后，马上置于300.5水浴锅内，准确计时30min10s（要求每个试样加入尿素缓冲液的时间间隔保持一致）。停止反应时再以相同的时间间隔加入10ml盐酸（0.1mol/L），振摇后迅速冷却至20，将比色管内容物全部转入锥形瓶中，用20ml蒸馏水冲洗数次，加8-10滴混合指示剂，以KOH标准溶液滴定至蓝绿色。另取纳式比色管作空白，称0.2g样品，加入10ml盐酸，振摇后加10ml尿素缓冲液，立即盖好剧烈振摇，马上置于300.5水浴锅，计时保持30min10s，停止反应时将其迅速冷却至20将比色管内容物全部转入锥形瓶中，用20ml蒸馏水冲洗数次，加8-10滴混合指示剂，以KOH标准溶液滴定至蓝绿色。四、计算：X=CKOH*（V0-V）14/（m30）；X：单位mg/（gmin），以氨态氮计；CKOH：氢氧化钾浓度；V0：空白消耗氢氧化钾溶液的体积，ml；V：样品消耗氢氧化钾的体积，ml；14：氮的摩尔质量，g/mol；m：样品质量，g；30：反应时间，min；五、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会使结果偏低；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.各样品加缓冲液和盐酸