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文档简介

PCR技术在医学检验中应用 1 医药交流PPT 主要内容 1 PCR的定义 2 PCR的基本原理 3 2 医药交流PPT 一 PCR的定义 PCR polymerasechainreaction 聚合酶链式反应 又称体外DNA扩增技术 是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的新技术 3 医药交流PPT PCR技术 1985年由美国的KaryMullis首创 可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上 优点 敏感度高 特异性强 产率高 重复性好以及快速简便等 广泛应用于微生物学 考古学 法医学及体育等领域 并已普及到许多普通实验室 大大简化了传统的分子克隆技术 从而比较容易地对目的基因进行分析 鉴定 4 医药交流PPT 二 PCR的原理 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段 类似于天然DNA的复制过程 以拟扩增的DNA分子为模板 以一对分别与模板5 末端和3 末端互补的寡核苷酸片段为引物 在DNA聚合酶的作用下 按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成 重复这一过程 即可使目的DNA片段得到扩增 5 医药交流PPT 扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异性结合 一个典型的PCR反应包括 变性 退火 延伸 的多个循环 其一般反应过程为 1 变性 Denaturation 将体系加热至 95 30 使模板DNA互补双链间的氢键断而解离成为两条单链DNA 以便他与引物结合 为下轮反应做准备 6 医药交流PPT 2 退火 复性 Annealling 将体系温度突然将温度降至 55 左右 后寡核苷酸引物与模板DNA单链上的互补序列杂交 按碱基互补配对原则结合 同时 体系中的部分DNA聚合酶被激活 一旦引物与模板杂交 DNA聚合酶就结合到杂交序列上使引物开始沿着模板DNA延伸 这一步对扩增产物特异性有重要的决定作用 7 医药交流PPT 3 延伸 Extension 将反应体系温度升至DNA聚合酶的最佳扩增温度 72 与模板DNA结合的引物在DNA聚合酶的作用下 以dNTP作为反应原料 以引物的3 端开始 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条与模板DNA链互补的新DNA链 8 医药交流PPT 上述3步为一个循环 每经过一个循环 样本中的DNA量应该增加一倍 新形成的链又可成为新一轮循环的模板 重复以上3步 根据需要的量 经过25 40个循环 DNA可扩增106 109倍 在PCR反应中 每一个循环都以前一循环完成后的所有产物为模板 因此 扩增产物是以指数方式增长的 2n 9 医药交流PPT 25 40个循环 10 医药交流PPT 11 医药交流PPT 12 医药交流PPT 三PCR反应体系的组成 在常
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