谷子雄性不育系中晚熟性状 QTL 定位及分子标记开发-课题立项申报书

谷子雄性不育系中晚熟性状 QTL 定位及分子标记开发（一）立项依据与研究内容（建议 8000 字以内）：1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；谷子具有抗旱、耐瘠薄特性，在山西有机旱作农业发展中占有优势地位，同时作为发展小杂粮产业的领衔农作物，其发展前景广阔， 这对于从事谷子育种及杂种优势利用研究工作是机遇也是挑战。杂种优势利用是作物培育高产、优质、高抗新品种的最主要手段， 而利用雄性不育系进行杂交育种又是杂种优势利用最经济、有效的途径之一，是杂种优势利用的关键步骤。国外对谷子不育系的研究报道甚少，仅见T aka-hahi N.报道了谷子雄性不育基因受一对隐性核基因控制（Ananthakalaiselvi A，1999 ），此后虽有多例谷子与狗尾草的种间杂交的报道，但均未涉及杂交后代不育系选育。在国内，谷子杂种优势利用研究始于 1969 年，至今已近 50 年的时间。对谷子不育系的研究先后经过谷子核质互作不育“三系”、“隐形高度雄性核不育”、“显性核不育”、“ 光(温)敏核不育”等方面的研究（朱光琴，1972； 崔文生等，1978、1991；胡洪凯等，1986；刁现民，1991；赵治海等,1996；王玉文等，2010 等）。选育出的不育系类型主要有“延型不等育系、蒜系、长 10A”等高度核不育材料和“光A_1、821A”等光(温)敏核不育材料。目前，在谷子中晚熟种植区，通过谷子育种家们的努力，已选育出一些性状优良的不育系，但都较早熟，仍然存在不育系与恢复系花期相差较远，使得不育系与恢复系必须错期播种的问题。这不仅加大谷子制种成本，不利于谷子杂交制种，而且极易造成制种失败， 给生产上大面积推广杂交种带来很大的阻力。因此，急需选育出适合谷子中晚熟区种植的谷子雄性不育系，从而推动谷子中晚熟区杂种优势利用研究。现阶段不育系的选育主要有两种方法，一种是传统育种，另一种是分子育种。传统育种方法选育不育系存在准确率不高、效率较低等问题。分子育种即在传统育种的基础上加入现代生物技术，主要包含分子标记辅助选择和基因工程育种。自 20 世纪 80 年代以来，随着分子标记的应用和遗传统计学的发展，QTL 定 位技术也得到快速发展。利用 QTL 定位，能检测出目标性状在染色体上的位置及其效应， 为进一步进行图位克隆及复杂数量性状的研究提供方法。近年来，关于农作物成熟期性状的QTL 定位有不少研究。Lindhoutl 等在番茄 2号染色体上发现 3 个与早熟相关的 QTL 位点，主要控制番茄开花时间、结果时间及果实成熟时间，贡献率分别为 4%、9%、16%，其中有两个位点与果重呈负相关，并推测控制两性状的基因不是一基因多效作用，而是连锁关系（Lindhoutl et al., 1994)。陈学军利用 F2 分离群体构建了极早和极晚近等基因池，对辣椒早熟基因进行了研究，研究发现有一基因序列与拟南芥的一个未知蛋白的编码序列具有40.2%的同源性。而且有一与辣椒早熟性基因存在连锁关系的特异片段，并验证了该片段的存在（陈学军, 2006)。邓晓建等研究发现一早籼核不育系具有完全显性早熟特性，对 F2 和 B1F2 群体进行遗传分析，结果表明该早熟性主要受 2 对显性基因控制，利用F2 群体将该早籼核不育系携带的1 个显性早熟基因定位于水稻第3 染色体短臂靠近端部一侧。该基因为控制水稻完全显性早熟性的主基因，是首次发现并定位，暂命名为 Ef-cd(t)(邓晓建等, 2003)。由此可见，分子技术可直接对基因型进行选择，不受生长时期和环境因素的影响，极大的提高了选择的准确性和效率。因此，在传统育种的基础上加入分子技术的辅助手段可显著的提高育种效率，减少工作量，缩短育种年限。针对目前传统育种方法进行谷子中晚熟不育系选育中瓶颈问题，周期长、效率低，而且由于连锁累积导入不良基因。本项目开展“谷子雄性不育系中晚熟性状QTL 定位及分子标记开发”研究，把控制生育期的多个 QTL 先行定位，找出主效 QTL， 再用基因聚合的方法把多个主效 QTL 导入到同一个性状优良但早熟的谷子雄性不育系中，这样提高育种效率。另外，通过将亲本的测序结果与参考基因组进行比对，搜索插入缺失位点，开发谷子雄性不育系中晚熟性状相关 QTL 分子标记。为谷子熟性机制的研究奠定一定基础，所开发的分子标记对于中晚熟谷子雄性不育系的分子标记辅助育种具有重要意义。参考文献1 刘正理.谷子杂种优势群的构建方法及研究进展J.河北农业科学,2010,14(11): 102-104.2 朱光琴.谷子雄性不育育种小结J.陕西农业科技,1972(5):15-16.3 崔文生,马洪锡,张德勇,等.谷子雄性不育系“蒜系 28”的选育与利用J.中国农业科学,1978,9(1):43-46.4 崔文生,孔玉珍,杜贵,等. 谷子光敏型显性核不育材料“光 A_1”选育研究初报J. 华北农学报,1991,S1.5 胡洪凯, 马尚耀, 石艳华, 等. 谷子(Setaria italica) 显性雄性不育基因的发现J. 作物学报,1986,19(2):73-78.6 刁现民,杜瑞恒,王天宇等. 谷子 Ch 型显性雄性核不育花药在发育的细胞形态学研究J. 华北农学报,1991,6(1):13-17.7 赵治海,崔文生,杜贵,等.谷子光(温)敏型不育系 821 选育及其不育性与光温关系的研究.中国农业科学,1996, 29(5): 23-31.8 王玉文, 李会霞, 田 岗, 等. 谷子高异交结实雄性不育系的创制及应用J. 中国农业科学,2010,43(4):680-689.9 姚瑞. 杂交谷子种植情况调研报告J.现代农村科技,2010,08:4-5.10 高用明,朱军.植物 QTL 定位方法的研究进展J.遗传,2000,22(3):175-179.11 杨 睿, 杨兴圣, 刘联正, 等. 小麦熟期相关性状的 QTL 定位分析J. 麦类作物学报,2012,32(3):399.12 车京玉,刘春燕,蒋洪蔚,等.基于元分析的大豆成熟期单片段代换系鉴定与 QTL 定位 J. 中国农业科学,2013,46,(22):4646.13 董维.高粱生育期等性状的 QTL 定位研究 D.南京:南京大学,2012:38.14 田锋.陆地棉早熟相关性状的遗传分析及 QTLs 定位研究 D.阿拉尔: 塔里木大学,2017: 34.15 王海杰,杨存义,江炳志,等.大豆生育期性状 QTL 定位 J.中国油料作物学报,2010,32（3）: 362.16 李景富, 彭 艳, 许向阳, 等. 番茄早熟性及 QTL 定位的研究J. 东北农业大学学报,2015,46(6):7.17 陈书霞,王晓武,方智远,程智慧,孙培田.芥蓝甘蓝的 F2 群体抽薹期性状 QTL 的 RAPD 标记J.园艺学报,2003,30(4):421-426 .18 陈学军. 辣椒早熟性状遗传分析、相关基因分子标记及辣椒属栽培种遗传多样性分析. D.南京农业大学, 2006.19 邓晓建,周开达,李仁端,淳泽,李平,王文明,翟文学,朱立煌. 水稻完全显性早熟性的发现和基因定位J.中国农业科学, 2003, 34(3): 233-239.20 雍伟东, 种康, 许智宏, 等. 高等植物开花时间决定的基因调控研究. 科学通报, 2000 ,45( 5): 455-466.21 Abe A., Kosugi S., Yoshida K., et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap. Nature Biotechnology, 2012, 30(2): 174-178.22 Ananthakalaiselvi A,Krishnasamy V, Vijaya J.Stigma re-ceptivity and pollen viability studies in hybrid pearlmillet kmJ.The Madras Agricultural Journa,1999,86 (10/12): 603-605.23 Boss PK, Bastow RM, Mylne JSl. Multiplepathways in the decision to flower : enabling, promoting , and resetting. Plant Cell, 2004 , 16 :18-31.24 Blazquez MA, Ahn JH, Weigel D. A thermosensory pathway controlling flowering time in Arabidopsis thaliana. Nat Genet, 2003, 33:168-171.25 Ferreira ME, Satagopan J, Yandell BS, Williams PH, Osborn TC. Mapping loci controlling vernalization requirement and flowering time in Brassica napusJ. Theor Appl Genet, 1995, 90:727732.26 Javed N, Geng JF and Tahir M. Identification of QTL influencing seed oil content, fatty acid profile and days to flowering in Brassica napus L.Euphytica, 2015, online, pp1-2127 Kale S. M., Jaganathan D., Ruperao P., et al. Prioritization of candidate genes in “ QTL-hotspot” region for drought tolerance in chickpea (Cicer arietinum L.). Scientific Reports, 2015, 5(15296).28 Lu H., Lin T.,Klein J.,et al.QTL-seq identifies an early flowering QTL located near flowering locus T in cucumber. Tag.theoretical and Applied Genetics.theoretische Und Angewandte Genetik, 2014, 127(7): 1491-1499.29 Lindhoutl P, Heusden S V, Pet G, Johan W, Ooijen V, Sandbrik H, Verkerk R, Vrielink R, Zabel P. Perspectives of molecular marker assisted breeding for earliness in tomatoJ.Euphytica, 1994, 79:279-286.30 Mouradov A, Cremer F, Coupland G. Control of flowering time: interacting pathways as a basis for diversity. Plant Cell, 2002, 14 Suppl:S111-130.31 Singh V. K., Khan A. W., Jaganathan D., et al. QTL-seq for rapid identification of candidate genes for 100-seed weight and root/total plant dry weight ratio under rainfed conditions in chickpea. Plant Biotechnology Journal, 2016, 14(11): 2110-2119.32 Takagi H., Abe A., Yoshida K., et al. QTL seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations. Plant Journal for Cell and Molecular Biology, 2013a, 74(1): 174-183.33 Varshney R. K., Terauchi R., Mccouch S. R. Harvesting the promising fruits of genomics: applying genome sequencing technologies to grop breeding. PLoS Biology, 2014, 12(6): e1001883.2. 项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（ 此部分为重点阐述内容）；2.1 研究内容2.1.1 谷子熟性遗传区段挖掘与分子标记开发（1） 分离群体熟期性状分布与鉴定（2） 群体 DNA 的提取、混池构建与质量检测（3） 中晚熟性状遗传区段筛选、标记开发与验证2.1.2 遗传图谱构建与谷子中晚熟性状 QTL 定位（1） 多态性标记群体检测（2） 遗传图谱构建与 QTL 定位2.2 研究目标（1） 获得与谷子雄性不育系中晚熟性状相关的紧密连锁的候选遗传区段，在遗传区段开发谷子中晚熟性状相关分子标记；（2） 确定谷子熟性相关候选基因位点，从而为谷子生育期的遗传改良提供理论参考。2.3 拟解决的关键问题（1） 定位控制谷子雄性不育系生育期的多个 QTL ，找出主效QTL；（2） 再用基因聚合的方法把多个主效 QTL 导入到同一个性状优良但早熟的谷子雄性不育系中，在解决谷子中晚熟区亲本花期不遇问题中提高育种效率。3. 拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）；3.1 研究方案3.1.1 研究方法（1） 试验材料供试材料为长生 07（父本）和晋高 1A（母本），母本由山西省农业科学院高粱研究所选育而成，父本由山西省农业科学院谷子研究所选育而成。（2） 群体性状鉴定2020 年 5 月在山西榆次高粱研究所试验基地配制长生 07（父本） 和晋高 1A（母本）的杂交种，同年 11 月在三亚南繁育种基地种植F1，2020 年 3 月底 4 月初收获 F2 代种子，2020 年 5 月中下旬种植 F2 代分离群体，根据该分离群体的熟性性状，按生育期长短，将熟性分类。（3） 基因组DNA 的提取、混池构建亲本及后代基因组 DNA 提取：采集供试材料双亲及 F2 后代的幼嫩叶片，采用 CTAB 小量法分别提取基因组DNA。DNA 混池构建：利用打孔器分别取极端早熟与 极端晚熟后代材料的叶片 1 片于盛有液氮的研钵内，用研磨棒充分研磨成粉末，再分装到多个 1.5mL 的离心管中，后续提取方法同上；将所有的离心管中的混合DNA 进行充分混合，构建 DNA 混池。（4） 差异区段筛选与标记开发建库测序及数据预处理：将质量检测合格的亲本 DNA 与极端后代 DNA 混池，进行高通量简化基因组测序。利用 2b-RAD 技术构建谷子上述 4 个样品的标签测序文库，4 个样品在 Hiseq2500 v2 平台进行单末端测序，采用标准型NNN 接头建库。将原始reads 进行质量过滤，剔除不含有 BsaXI 酶切识别位点的序列，剔除低质量序列以及剔除有 10 个以上连续相同碱基的序列。全基因组范围SNP 筛查和分型：只留取标签内最多有 3 个SNP的标签位点，在个体内标签深度在 500 以上的不进行分型。特异标签密度分布图构建与差异区间筛选：根据以上分型结果，利用 Matlab 软件对 4 个样品中的标签分布情况，构建染色体标签密度分布图；通过数据分析，筛选出每个样品中的特异标签，再分别构建特异标签密度分布图；比较样品间的特异标签密度分布，最终获得特异标签密度绝对值的分布图。在 2 个极端后代混池样品中，根据染色体标签密度分布图及特异标签密度分布图，筛选出标签密度差异较大的染色体区段。若在染色体上的某一特定区段，其中 1 个极端混池有高密度的特异标签，而另一极端混池的特异标签密度很低，那么该染色体区段就是候选差异区间。引物检测：利用中晚熟父本与早熟母本的基因组 DNA 为模板进行PCR 扩增，扩增产物利用浓度为 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测引物的质量及特异性。PCR 扩增产物酶切选择在双亲中均能扩增出清晰且无差异条带的引物，利用 BsaXI 限制性内切酶对 PCR 产物进行酶切，并利用浓度为 2%的琼脂糖凝胶进行检测。标记在极端后代中的验证：选择只在某一亲本中可酶切，而另一亲本中不可酶切的引物，开发 CAPs 标记；只在某一亲本中扩增出条带，而另一亲本未扩增出条带的引物，或者在两亲本中扩增出不同条带的引物开发SCAR 标记，利用后代极端早熟与极端晚熟材料进行验证，PCR 扩增与产物检测方法同上。若亲本与极端后代材料间表现出一定的规律性，即极端早熟材料与早熟母本晋高 1A 一致，极端晚熟材料与晚熟父本一致，那么该标记与熟性性状紧密连锁。否则，该标记与熟性性状不连锁。（5） 构建遗传连锁图谱，目标性状 QTL 定位。根据分子标记扩增结果，统计多态性条带，利用作图软件构建遗传连锁图谱，结合群体性状鉴定结果，进行谷子生育期QTL 定位。3.1.2 技术路线晋高1A不育系（早熟）长生07（晚熟）F1 代早熟材料极端早熟DNA亲本DNAF1 代晚熟材料极端晚熟DNA高通量简化基因组测序 挖掘遗传区段与标记开发不同熟性品种验证分离群体验证构建遗传图谱确定生育期相关基因位点分子辅助育种标记3.1.3 实验手段QTL-seq 是一种结合 BSA 与 NGS 来快速定位单个数量性状的方法。具体做法如下：选取目标性状差异大的两个亲本杂交，产生分离群体如 F2、RILs、DH 等，目标性状理论上将会呈现正态分布，选取目标性状表型极端的 20%的比例的个体分别混合成两个表型极端池，进行重测序。以对照亲本的基因型为参照，计算子代极端池中的 SNP-index（Abe et al., 2012）。通过比较两个极端混池的 SNP-index差值（SNP-index）（Abe et al., 2012），理论上，从而将 QTL 定位到了基因组上的某一区域。F2、RIL 与 DH 群体均可以作为 QTL-seq的目标群体，由于RIL 与DH 群体表型测量的可重复性，因此他们可以用来检测微效 QTL，而 F2 群体仅仅适用于检测主效 QTL，并且群体代数越高性状关联的效果越好，这是由于群体代数越高，那么纯合基因型的比例就越高，从而导致混池的基因型更加极端，那么 SNP-index 值会更加接近于 1（Takagi et al., 2013a; Lu et al., 2014; Singh et al., 2016）。QTL-seq 定位方法更有效地提高了定位候选基因组区域的速度、精度与准度（Takagi et al., 2013a; Qi et al., 2014; Varshney et al., 2014; Kale et al., 2015; Singh et al., 2016）。高通量简化基因组测序(Reduced-representation sequencing) 是在第二代测序基础上发展起来的一种测序技术。该技术首先利用不同类型的限制性内切酶对物种基因组进行酶切或其他试验方法来简化物种基因组的复杂程度，再针对基因组的某些特定区域进行测序，从而可反映出部分基因组序列的结构信息(王洋坤等, 2014)。目前，运用比较广泛的简化基因组测序有以下三种：复杂度降低的多态序列测序（CroPS）（Altshuler et al., 2000），限制性酶切位点相关的 DNA 测序（RAD）（Davey et al., 2010），基因分型测序(GBS)( Elshire et al., 2011)。RAD-seq 技术的应用最为广泛。该技术首先利用特定的限制酶对基因组进行酶切，获取限制性内切酶酶切位点附近区域的DNA 序列，在序列两端添加接头 1。在不考虑酶切片段的长度的情况下， 将酶切片段进行随机打断，获得适合于测序平台的长度的片段，再添加接头 2，对产生的 RAD 标记进行高通量测序，最终可获得大量的SNP 标记(Miller et al., 2007; van Tassell et al., 2008)。该技术具有以下几方面的优点：首先，相对于传统的分子标记开发方法，该技术一次测序所开发的 RAD 标记通量高而且准确性高；其次，由于该技术可降低基因组的复杂度，可降低测序成本，所以性价比高；再次，该技术无需参考基因组，对于没有参考基因组的物种也同样可以进行大量标记的筛查；最后，由于该技术通量高，与传统标记的开发相比，极大缩短了标记的开发周期，提高工作效率（王洋坤等, 2014）。RAD-seq 已成功应用于模式生物及非模式的遗传学与基因组学研究，如，SNP 标记的开发、高密度遗传图谱的构建、动植物重要性状的QTL 定位、群体遗传结构、系统进化分析等领域研究(Emerson et al., 2010; Hohenlohe et al., 2011; Pfende et al., 2011; Poland et al., 2012)。3.1.4 关键技术2b-RAD 技术利用IIB 型限制性内切酶（如 Bsa和 Alf）对基因组 DNA 进行酶切。该限制酶可识别双链 DNA 的 6 个特异碱基对，在识别位点的上下游进行酶切，产生长度为 33bp 的序列标签，标签连接接头，进行 PCR 扩增，选择片段后上机进行高通量测序。与传统的RAD 技术相比，2b-RAD 技术又有以下三方面的优势：首先，无需将 DNA 片段进行打断。2b-RAD 技术酶切完基因组后，无需再次将片段进行打断，直接连接接头，进行 PCR 并测序即可，所以建库更加简便，省时。其次，可调节标签密度。2b-RAD 技术可以根据研究目的和测序成本的不同，较灵活地通过控制接头 3末端的碱基对获得的标签密度进行调节。最后，标签大小一致。传统的 RAD 技术获得的标签长度不一，PCR 扩增时往往不均匀。而 2b-RAD 所使用的 IIB 型限制性内切酶酶切获得的标签长度均为 33bp，因而在PCR 时扩增效率一致性高（付晓腾，2014）。Jiao 等利用 2b-RAD 技术，构建了栉孔扇贝（Chlamys farreri）的高密度遗传连锁图谱（Jiao et al., 2013; Jiao et al., 2014），该图谱包含了 3806 个分子标记，标记间的平均距离为 0.41cM，基因组覆盖率高达 99.5%，结合表型性状定位到与生长及性别相关的QTL。3.2 可行性分析：（1） 试验设计思路我们拟利用现有早熟谷子不育系晋高1A 和晚熟优质品系长生07 杂交，分子标记辅助传统育种手段，这种对谷子不育系进行目标性状的改良已在一些谷子不育系的创新与利用中获得成功，只是在谷子熟性目标性状利用报道较少，因此，项目在理论层面具备可行性。（2） 实验平台本项目依托单位山西省农业科学院高粱研究所在晋中市榆次区修文镇建立有试验基地，在海南三亚拥有南繁育种基地，所内建有“高粱遗传与种质创新山西省重点实验室”。可提供试验用地 10 亩，晾晒场和挂藏式，实验室拥有常用的分子生物学仪器、完善的基因转化平台。可进行高通量简化基因组测序，确定熟性相关基因位点，从而实现分子标记辅助育种。（3） 技术支撑本项目主持人工作以来，一直专注于谷子杂种优势研究与利用， 近年来针对谷子中晚熟区发展瓶颈，谷子中晚熟雄性不育系选育深入研究，已有一定的理论基础和实践经验。项目成员大都是“谷子杂种优势研究与利用”的团队成员，或参加了有关谷子不育系创制与利用的项目，并成功转育几个含目标性状的不育系，对谷子不育系更有深刻的认知能力。全体项目成员都有相关的理论与实践经验。因此，课题主持人和团队成员具有技术优势及把握前沿动态、合理设计科研思路、开展科学研究的能力，完全可以保证课题顺利进行。4. 本项目的特色与创新之处；针对目前传统育种方法进行谷子中晚熟不育系选育中存在周期长、效率低，且由于连锁累积导入不良基因等弊端。（1） 开发谷子雄性不育系中晚熟性状相关QTL 分子标记，为谷子熟性机制的研究奠定一定基础；（2） 利用开发的分子标记对谷子中晚熟基因型直接进行选择， 在传统育种的基础上加入分子技术的辅助手段可显著的提高谷子中晚熟不育系育种效率，减少工作量，缩短育种年限。5. 年度研究计划及预期研究结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）。5.1 年度研究计划2020 年 1 月2020 年 12 月2020 年 5 月至 10 月在山西省农业科学院高粱研究所试验基地（榆次东白）种植配制晋高 1A 和长生 07 杂交单株。同年 11 月在高粱研究所三亚育种基地种植F1 代；2021 年 1 月2021 年 12 月2021 年 3 月底在三亚育种基地收获 F2 代群体的种子。5 月中下旬在山西榆次育种基地种植F2 代单株群体，生育期间调查统计表型数据，确立 F2 代单株基因型。提取亲本 DNA 和F2 代群体 DNA，利用两亲本和极早熟、极晚熟 DNA 池，挖掘遗传区段与谷子中晚熟标记开发；2022年1月2022年12月 构建遗传图谱，确定谷子生育期相关基因位点，不同熟性材料验证分子标记。分析整理数据撰写发表论文，总结研究结论，撰写结题报告。5.2 预期研究结果（1） 高通量简化基因组测序，筛选谷子全基因组范围内的SNP位点，获得两个极端混池的特异标签；（2） 挖掘与谷子雄性不育系生育期性状紧密连锁的遗传区段， 对候选区段基因分析，分子标记开发与验证；（3） 遗传图谱构建与谷子生育期性状QTL定位；（4） 发表学术论文1-2篇。（二）研究基础与工作条件1. 研究基