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本科毕业论文(设计)：展青霉素印迹传感器制备及性能测试 本科毕业论文(设计)：展青霉素印迹传感器制备及性能测试 年 月 日目 录摘要1Abstract11引言22实验部分32.1 仪器与试剂32.2 电极的预处理42.3 金纳米粒子多壁碳纳米管修饰金电极的制备42.4 印迹膜传感器的制备52.5检测方法63结果与讨论63.1印迹电极制备63.1.1 PAT的电化学行为63.1.2 分子印迹膜的形成73.2 PAT与PCA间相互作用的光谱表征83.3 分子印迹电极的电化学表征83.3.1 循环伏安表征83.3.2 交流阻抗表征103.4分子印迹电极的线性范围及检出限114 结论12参考文献13致谢15摘要 以展青霉素（PAT）为模板，对氯苯胺(PCA)为单体，在金电极表面自组装多壁碳纳米管(MWCNTs)，通过电聚合制得PAT/ PCA / MWCNTs/AuNPs聚合薄膜及安培传感器。采用循环伏安法和交流阻抗技术对传感器制备过程进行表征，用紫外光谱法研究了单体与模板间的相互作用。实验结果表明，K3Fe(CN)6探针分子的示差脉冲伏安曲线峰电流与PAT浓度在0.659.1 mol/L范围内呈良好的线性关系，PAT的检出限为0.2 mol/L。关键字：电化学传感器;多壁碳纳米管;展青霉素;对氯苯胺;金纳米粒子AbstractA novel amperometric sensor based on Patulin (PAT) imprinted polymer membrane was fabricated on gold electrode for the detection of PAT by self-assembly of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) and electropolymerization of p-chloroaniline (PCA) in the presence of template molecule. The modification procedure was characterized via cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. The interaction between PCA and PAT was confirmed by ultraviolet spectroscopy. In the presence of K3Fe(CN)6 as redox probe, the peak current of differential pulse voltammmogram decreased linearly with the increasing concentration of PAT from 0.65 to 9.1 mol/L. The detection limit was 0.2 mol/L (S/N=3). Keywords: Electrochemical sensor; Multi-walled carbon nanotubes; Patulin; p-Chloroaniline; Gold nanoparticles1引言 真菌毒素(mycotoxins, MT)是饲料或谷物中霉菌产生的代谢产物，广泛污染农作物、食品及饲料等植物源性产品。MT可能引起人类和动物的急性或着慢性中毒,部分已被证实具有极强的毒性和致癌、致畸、致细胞突变等“三致”作用1-2。目前已知的真菌毒素有300多种，按其主要菌种可分为曲霉菌毒素，镰刀菌毒素，以及青霉菌毒素。我国规定小麦、玉米中黄曲霉毒素的限量值分别为5 g/kg和20 g/kg, 而国际食品法典委员会标准中是按黄曲霉毒素总量(AFB1+AFB2+AFG1+ AFG2)指标制定限量指标,限量值在1020 g/kg 3。 展青霉素(Patulin，PAT)又称棒曲霉素，是由许多隶属于青霉菌属和曲霉菌属的真菌所产生的一种有毒的次级代谢产物4，人类摄取PAT会导致急性中毒，其具有致畸、致癌和致突变作用5。展青霉素主要存在于霉烂的苹果及其制品中，在樱桃、杏、柑橘与番茄中也被检出6。 目前，国内外对展青霉素在果蔬制品中的含量有严格的规定，很多国家将果汁中的展青霉素残留量限量在2050 g/kg之间5。 目前测定展青霉素的方法主要有高效液相色谱法7、高效液相色谱-质谱联用法8、固相萃取法9、多功能净化柱净化法10、薄层色谱法11、气相色谱法12等。这些方法某种程度上存在定量准确性不高、重现性难以控制、消耗大量有机溶剂、操作步骤较为繁琐等缺陷。分子印迹技术（MIT）是通过模板分子制备成三维聚合物基质13。模板的去除后，得到的印迹孔洞与模板分子的形状和官能团保持一致形成互补。MIP技术已被证明是一种低成本、简单、可靠和应用于传感器领域最有前途的技术，以及广泛应用于模板分子与功能单体的筛选14。多壁碳纳米管（MWCNTs）因具有良好的导电性，化学稳定性和机械强度等优势而被广泛应用于构建电化学传感器以增大比表面积，提高电导率和电子传递速率15。金纳米粒子（AuNPs）具有比表面积大，生物相容性好、导电率高等优点。同时，自组装膜（SAMs）因拥有强烈的可诱导化学吸附和衬底之间的有机分子16而广泛应用于构建电化学传感器件。本文先在金电极表面自组装形成有序的(MWCNTs/AuNPs)的单层膜，然后通过分子印迹技术制备了PAT印迹 MWCNTs/AuNPs聚合物薄膜电化学传感器。MWCNTs和AuNPs的使用提高了印迹传感器的响应稳定性和灵敏度。实验采用紫外光谱法研究单体与模板间的相与作用，以K3Fe(CN)6为分子探针，通过差分脉冲伏安法实现了对PAT的定量分析。2实验部分 2.1 仪器与试剂 CHI66D 电化学工作站（上海辰华仪器公司），UV-3600紫外分光光度计（日本岛津公司），SG8200APT超声清洗器（上海冠特超声仪器公司），三电价体系：以裸金电极或分子印迹膜修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。 展青霉素（PAT，98.8%）(青岛普瑞邦生物有限公司)、对氯苯胺（PCA，98%）(上海aladdin公司)、多壁碳纳米管、氯金酸（HAuCl4, 47.8%）(上海aladdin公司)、铁氰化钾K3Fe(CN)6(上海aladdin公司)、NN二甲基甲酰胺，乙腈（成都金山化学试剂公司）。不同pH的0.1mol/L磷酸缓冲溶液（PBS）用0.2mol/L KH2PO4和Na2HPO4，加0.1mol/L KCl电解质配制；其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水，由Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制备。 2.2 电极的预处理 将直径为2 mm的金电极依次经1.0、0.05 m Al2O3悬浮液抛光成镜面后，放入Piranha溶液（30% H2O2与浓H2SO4体积比为3:7）中浸泡10 min，然后分别用无水乙醇、超纯水超声清洗10 min。再将电极放入0.5 mol/L H2SO4溶液中于0.41.2 V范围内进行循环伏安法扫描至稳定，取出用超纯水洗净备用。 2.3 金纳米粒子多壁碳纳米管修饰金电极的制备 羧基接枝在MWCNTs表面能增强MWCNTs的分散性和稳定性。将5 mg MWCNTsCOOH分散在5 mL NN二甲基甲酰胺和5 mL超纯水混合溶液中超声搅拌20 min，得到均匀的多壁碳纳米管的悬浮液。然后，将10 L制取所得的多壁碳纳米管的悬浮液涂在金电极上于室温下干燥。 将所制备的MWCNTs修饰金电极浸泡在2.43 mmol/L HAuCl4与0.1 mol/L H2SO4的溶液中于0.2 V电位恒定200 s。然后，用乙腈和超纯水漂洗几次后于室温下干燥，即制得MWCNTs/AuNPs电极。 2.4 印迹膜传感器的制备 PCA修饰的MWCNTs/AuNPs金电极的制备参考文献18。将所制备的金纳米粒子多壁碳纳米管修饰的金电极浸渍在含5 mm PCA的乙腈溶液中，在室温放置24 h后取出，分别用乙腈和超纯水漂洗以去除物理吸附的PCA。然后浸渍在含0.13 mmol/L展青霉素的乙腈溶液在常温下自组装24 h，用乙腈和超纯水漂洗以除去物理吸附的模板分子，然后在室温温度下干燥。另配制含有0.26 mmol/L PCA，510-2 mol/L NN四丁基铵高氯酸盐，0.13 mmol/L PAT和0.4 g/L HAuCl4乙腈溶液17的聚合底液，超声分散5 min,放置在4的冰箱中过夜，使模板分子与功能单体充分的发生反应。将PAT和PCA修饰的金纳米多壁碳纳米管金电极浸渍在聚合底液中，在0+1 V的范围内，用CV法以50 mV/s的速率下电化学聚合20个周期，使聚合膜沉积在组装后的金电极表面。然后将电极用乙腈和超纯水小心的漂洗以除去电极表面物理吸附的残留单体和模板分子。放置于室温下干燥，即制得（PAT/PCA/MWCNTs/AuNPs/Au)(MIP)电极，非印迹膜(NIP)电极（PCA/MWCNTs/AuNPs/Au)的制备在自组装和电聚合过程中均不加PCA，其余步骤与印迹膜(MIP)电极相同。将MIP电极浸渍在乙酸乙酯/乙醇(4/1，V/V)含0.5 mol/L HCl溶液30 min洗脱模板分子，NIP电极也要进行同样的处理。 2.5检测方法 以K3Fe(CN)6为探针,用示差脉冲伏安法(DPV)进行模板展青霉素的含量检测。检测电位区间为0.20.8 V,电压增量为0.004 V,脉冲振幅为0.05 V,脉冲宽度为0.05 s。测试底液为含 0.1 mol/L KCl和5 mmol/L K3Fe(CN)6的磷酸缓冲溶液(pH 7.0)，测试前电极在乙酸乙酯/乙醇(4/1, v/v)溶液中浸泡至背景电流恢复。3结果与讨论 3.1印迹电极制备3.1.1 PAT的电化学行为 图3.1.1 PAT在修饰金电极上的循环伏安法 实验考察了模板分子PAT在MWCNTs/AuNPs修饰金电极上的电化学行为，结果如图1所示。在扫描电位为0.41.2 V范围内，PAT没有出现氧化还原峰，说明PAT没有在组合电极表面发生电化学反应，即在此电位范围内PAT是稳定的，所以在电位扫描过程中PAT不会发生结构改变。 3.1.2 分子印迹膜的形成 图3.1.2是PAT电化学聚合的循环伏安图，在电位01.0 V之间扫描，扫描速度为50 mV/s。图3.1.2 PAT印迹膜的电聚合CV图从图中可以看到在0.10.7 V电位范围内有一对氧化还原峰，0.55 V处为氧化峰、0.25 V处为还原峰。0.25 V处的还原峰会随着扫描次数的增加而增大，这可以表明在组合电极上有聚合物生成。当扫描超过15个周期时电流趋于稳定，说明形成了比较稳定的膜结构。为了得到致密和更稳定的聚合膜，实验扫描到20周期为最佳。 3.2 PAT与PCA间相互作用的光谱表征图3.2 不同PAT与PCA浓度配比的紫外吸收光谱为了研究模板分子PAT与功能单体PCA间的相互作用，以乙腈为溶剂，配制两组PAT与PCA的浓度比分别为1:1, 1:2, 1:3和1:4的组装溶液，一组放置1h后用紫外分光光度计进行分析，另一组放置24 h后用紫外分光光度计进行分析，结果如图3.2所示。组装溶液中浓度比为1:2的紫外吸收峰最大，放置24 h后所测得紫外吸收峰与另一组相同浓度比较，得出不同浓度的峰值差都很小，只有浓度比为1:2的组装溶液所测得的紫外吸收峰峰值差最大。所以实验选择模板分子PAT与功能单体PCA的物质的量比为1:2来制备印迹聚合膜。 3.3印迹电极的电化学表征3.3.1 循环伏安表征 以K3Fe(CN)6溶液为探针，采用循环伏安法表征不同修饰电极制备过程中膜的电化学行为，结果如图3.3.1所示。1MWCNTs修饰电极；2MWCNTs/AuNPs修饰电极； 3-MIP修饰电极；4-NIP修饰电极；5-MIP修饰电极洗脱PAT后图3.3.1 不同修饰电极的循环伏安法扫描图3.3.1显示当电极表面覆盖一层MWCNTs，在CV中曲线1的氧化还原峰电流增加，表明碳纳米管的掺入改善了MWCNTs /金电极对K3Fe(CN)6电流的响应。CV扫描表面电沉积金纳米粒子得到曲线2，其氧化还原峰电流进一步增加，说明在MWCNTs/金电极表面电沉积AuNPs不仅提高了电化学信号和表面积，也为PCA提供了可植入的结合位点，使其电信号增强。在修饰了PAT印迹膜（曲线3）或非印迹膜（曲线4）的电极表面所形成的氧化还原峰电流很小，与曲线1比较几乎没有峰电流。说明电聚合形成的PCA聚合膜具有致密的膜结构，有效地阻碍了探针小分子在电极表面发生氧化还原反应。当洗脱模板PAT后（曲线5），氧化还原峰的峰电流明显的增加。原因是PAT在聚合膜中留下了与其空间构型相匹配的孔穴，这些带有识别位点的孔穴相连并与电极表面接触，探针小分子可以通过印迹孔穴形成的通道扩散到金电极表面，从而导致氧化还原峰峰电流增大。 3.3.2 交流阻抗表征法拉第阻抗是探测修饰电极表面状况的有效工具。实验在温度为20，频率范围为10106 Hz，激励电压为18.8 mV的条件下测试了不同修饰电极的交流阻抗行为，结果如图3.3.2所示。 aMWCNTs/AuNPs修饰电极；b-MIP修饰电极；c-MIP修饰电极洗脱PAT后；d-NIP修饰电极；图3.3.2 不同修饰电极的交流阻抗图 从图3.3.2可以看出，在高频部分出现规则的膜本体阻抗半圆，低频部分可观察到Warburg阻抗。随着电极表面印迹膜的形成，电极表面阻抗值剧烈增加，说明通过分别自组装PCA、PAT和电聚合PAT/PCA/MWCNTs/AuNPs 形成的印迹薄膜能够稳定地修饰在电极表面。其中NIP电极图中曲线d电极的阻抗最大，洗脱后电极图中曲线c比MIP修饰电极图曲线b电极的阻抗小。这些均与上述循环伏安法实验的结果一致。从曲线c同样得出，将印迹膜电极浸入乙酸乙酯/乙醇(4/1,v/v)溶液中洗脱除去PAT后，电极的阻抗明显减小。说明模板分子可以通过该方法进行洗脱。3.4印迹电极的线性范围及检出限图3.4 MIP电极对PAT的电流响应曲线，PAT浓度从a到g分别为0.65、2.6、3.9、5.2、6.5、7.8、9.1 mol/L在实验所制备的印迹电极上，K3Fe(CN)6探针分子的峰电流值随着 PAT标准溶液浓度的增大而减小，由此建立起间接测定PAT的化学方法。首先将印迹电极浸入含2.6 mol/LPAT的测试底液中，每隔1 min用差脉冲伏安法测定K3Fe(CN)6的峰电流。发现K3Fe(CN)6的响应电流值随着时间增加不断减小，10 min左右可以达到稳定响应电流值的95%以上，因此后续实验在含有不同浓度的PAT测试底液中吸附10 min。然后置于混合溶液中于0.20.8 V电位范围进行DPV扫描。图3.4 给出了印迹电极对不同浓度PAT的DPV响应曲线。K3Fe(CN)6的峰电流值与PAT的浓度在0.659.1 mol/L范围内呈线性关系(R2=0.9414)。由斜率可求得在信噪比为3时，印迹电极的检出限为0.2mol/L。4 结论分子印迹膜的电化学传感器，用于间接检测PAT。它是通过MWCNTs/AuNPs/Au电极在PAT、PCA和AuNPs混合溶液下电聚合，制备了分散均匀的PAT阴极薄膜电化学传感器。PAT分子被PCA氢键电聚合在金纳米粒子和多壁碳纳米管修饰的金电极表面，大大增加了印迹位点的数量。掺杂的金纳米颗粒增强的MIP传感器的灵敏度，特别是对于用MWCNTs修饰的金电极。因此，这种新型的印迹电化学传感器制备方法有望进一步应用到其他真菌毒素的分析检测中。参考文献1李鹏, 赖 卫华, 金晶. 食品中真菌毒素的研究J. 农产品加工 学刊, 2005, 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