肿瘤干细胞的动态演进及干预研究.doc

项目名称：肿瘤干细胞的动态演进及干预研究首席科学家：刘强 中山大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部一、关键科学问题及研究内容拟解决的关键科学问题：肿瘤干细胞的动态演进及干预研究。本项目将围绕“肿瘤干细胞的动态演进及干预研究”这一关键科学问题，选择造血和消化系统恶性肿瘤为研究对象，以肿瘤干细胞动态演进过程为切入点，通过体内外功能实验及临床标本验证“干性”及转移潜能调控中的关键基因，明确肿瘤干细胞演进的分子机制、关键调控分子和信号通路，探索靶向肿瘤干细胞演进过程的干预方法和手段，阐明肿瘤干细胞的演进过程及靶向干预肿瘤细胞动态演进过程的干预新模式。本研究将为肿瘤干细胞的动态演进模型及创新性靶标药物的临床应用提供充实的理论和实验依据，为攻克肿瘤开创新的突破口。围绕拟解决的关键科学问题，本项目的主要研究内容是： 1. 肿瘤干细胞的起始与动态演进机制：本课题组将运用TEL-AML1及PML-RAR白血病相关模型，探索白血病干细胞的动态演进过程（白血病起源细胞白血病前癌干细胞白血病干细胞）：（1）TEL-AML1 相关白血病起始和发展过程中起源细胞、Pre-LSC和LSC的鉴定，以及这些干细胞动态演进的遗传和表观遗传调控机制；（2）PML-RAR相关白血病起始和发展过程中不同阶段的干细胞鉴定和动态演进机制。另一方面，本课题组还将探讨肝癌干细胞在肝癌发生发展过程（原发、复发及转移）中的动态演进过程。 2. 肿瘤干细胞“干性”的分子调控及临床意义：（1）应用新一代高通量测序技术，系统分析全基因组、全外显子组、转录组、表观遗传组、代谢组等变化，绘制造血和消化系统肿瘤干细胞异质性相关基因序列谱、表达谱和表观遗传学图谱，分析肿瘤干细胞“干性”相关的调控分子及关键信号通路；（2）运用小鼠模型等体内外功能实验对候选分子在肿瘤干细胞动态演进过程中的功能进行鉴定，并通过临床标本检验肿瘤干细胞动态演进模型的临床意义；（3）结合本课题组已有工作基础，展开肿瘤干细胞细胞周期、非对称分裂等分子调控方面的细致研究。3. 肿瘤干细胞转移潜能获得的分子机制：肿瘤干细胞的“干性”决定着其转移潜能，EMT作为肿瘤转移的重要机制，与肿瘤干细胞的动态演进过程紧密关联，剖析二者之间的相互作用，将为寻找肿瘤发生及转移的靶点提供有力的理论基础：（1）利用肝癌转移动物模型，研究具有转移潜能的肿瘤干细胞的基因表达谱；（2）研究本课题初期筛选到的调节肿瘤干细胞“干性”相关基因促进EMT过程的可能性及机制；（3）在已有研究基础上，继续探索细胞增殖相关基因调节EMT及肿瘤干细胞生物学行为的机制；（4）结合临床标本研究EMT相关基因在转移性肝癌等消化系统恶性肿瘤的相关性。 4. 肿瘤干细胞的特异性干预靶点研究：针对肿瘤干细胞动态演进过程以及与“干性”、转移潜能相关的关键调控分子为靶点，建立特异性的干预手段：（1）结合本研究前期工作进展，针对肿瘤干细胞演化过程中关键分子和通路的遗传学和表观遗传学学改变，寻找可干预的靶点，设计特异性抑制分子；（2）深入探讨AKT抑制剂、XIAP抑制剂等在体内外对肿瘤干细胞增殖、抑制和凋亡的诱导作用，及相关下游信号通路的抗肿瘤分子机制；（3）研究肿瘤干细胞对细胞凋亡抵抗的新分子机制，在此基础上设计和筛选对肿瘤细胞和肿瘤干细胞具有更高促凋亡作用的靶向性凋亡诱导剂和增敏剂，研发新的抗肿瘤药物；（4）针对肿瘤干细胞的代谢调控机制，建立肿瘤干细胞代谢组学研究平台，开发具有临床应用前景的代谢靶向新药。二、预期目标恶性肿瘤是危害人类健康的常见病，肿瘤干细胞作为肿瘤组织存在的根源，在肿瘤的诊断与治疗中有着举足轻重的地位，本研究将充分利用国内丰富的肿瘤资源，发挥各合作单位的高水平人才和完善的实验平台，探索“肿瘤干细胞的动态演进及干预”。本研究以严重危害国民健康的血液和消化系统肿瘤为研究目标，在前期成功分离鉴定血液和消化系统肿瘤干细胞的基础上，充分利用新一代高通量测序平台，系统研究肿瘤干细胞动态演进过程及遗传学和表观遗传学的变化，成功筛选“干性”与转移潜能调控通路中的关键分子，通过体内外功能学实验的鉴定及临床标本的验证，进一步探讨其作为特异性干预靶点的潜在意义，开发系列药物来靶向肿瘤干细胞的动态演进过程，制定以肿瘤干细胞为靶标的分子干预策略，引领肿瘤干细胞研究领域的前沿。具体预期目标如下： 1. 阐明肿瘤干细胞的动态演进模型：发展前期研究成果，通过研究干细胞在白血病及肝癌中的起始和演化过程，阐明并完善肿瘤干细胞的动态演进模型（肿瘤起源细胞前体肿瘤干细胞肿瘤干细胞），及致瘤和非致瘤性肿瘤干细胞之间的互相演变，明确其重要调控机制，将引领肿瘤干细胞研究的国际前沿。 2.完善全基因组水平肿瘤干细胞遗传学和表观遗传学的分析平台： 新一代高通量测序技术的应用，能够快速、精确的获取全基因组水平的基因信息，包括突变和表达量变化等，目前该技术已经成熟地运用于检测肿瘤基因组体细胞突变和表达图谱。本项目力争建立并完善该分析平台，将其应用到血液和消化系统肿瘤干细胞的全基因组信息分析中。 3.明确肿瘤干细胞“干性”相关分子并验证其临床意义：肿瘤干细胞的自我更新、无限增殖和多向分化等“干性”特征是肿瘤干细胞发挥生物学功能的基础。结合前期工作基础和高通量测序方法筛选肿瘤干细胞“干性”、转移潜能调控通路的关键分子，运用免疫缺陷小鼠模型等体内外实验及临床标本，进行功能鉴定，并明确其临床意义，为阐明肿瘤干细胞的动态演进模型提供详细分子机制，为寻找有效的小分子抑制剂、开创特异性靶向干预手段而提供理论依据和应用基础。 4.明确肿瘤干细胞的转移潜能及其调控机制：结合初期研究基础和高通量测序技术筛选到的肿瘤干细胞“干性”、转移潜能关键调控分子、肝癌转移动物模型肿瘤干细胞基因表达谱等重要信息，开展系列体内外实验，探讨这些候选分子在肿瘤干细胞动态演进模型中促进转移/EMT的生物学行为作用机制，评估肿瘤干细胞与EMT过程中的可干预性靶点，为开发靶向干预药物提供依据。5.寻找肿瘤干细胞的靶向干预手段并评价其临床应用前景：针对肿瘤干细胞的动态演进过程，阐明肿瘤干细胞耐药的分子机理，揭示与此相关的遗传学和表观遗传学改变，筛选耐药细胞的分子标记物和治疗靶点；明确肿瘤干细胞凋亡通路的改变、设计并开发细胞凋亡的诱导剂和增敏剂；建立肿瘤干细胞代谢组学分析平台，开展肿瘤干细胞代谢及其调控机制的分析鉴定，在肿瘤干细胞能量代谢及其线粒体功能失调等领域的研究取得突破性进展，开发具有临床应用前景的代谢靶向新药；建立并完善规范化的肿瘤干细胞研究平台。 6.创新性研究成果及队伍建设：本课题组计划建立56个国内肿瘤干细胞研究平台；发现510个肿瘤干细胞靶点，争取完成临床前期实验研究；总结归纳研究成果，在相关领域SCI收录国际杂志上发表论文80篇以上（5分以上1520篇）；申报获得授权发明专利1020项；争取获得国家级科技奖励12项；主办国际肿瘤干细胞研讨会12次；国家杰出青年科学基金获得者23名；培养博士和硕士研究生100200名，产生百篇优秀博士论文12篇。三、研究方案（一）总体学术思路 肿瘤干细胞被公认为肿瘤发生的根源，是肿瘤耐药、复发与转移的根本，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，阐明其重要生物学功能及演变过程尤为重要。现有的肿瘤干细胞模型（肿瘤干细胞模型和克隆演变模型）仍不能全面解释其发展演变过程，从而掩盖了肿瘤干细胞发展的关键过程。因此，全面概括并提出描述肿瘤干细胞演变过程的新模式及在此基础上对肿瘤干细胞“干性”等生物学特征的研究是非常重要的，将为探寻肿瘤干细胞特异性靶点带来思路，并为靶向干预肿瘤干细胞的转化医学研究提供理论基础。 基于以上思路，本研究旨在从现有的肿瘤干细胞模型出发，以白血病和消化道肿瘤为研究对象，深入研究肿瘤干细胞演化过程及其各阶段与“干性”密切相关调控通路，阐明“肿瘤干细胞的动态演进过程”及分子机制，以此来带动该领域关于遗传学及表观遗传学的研究。深入探讨肿瘤干细胞的“干性”以及转移潜能（EMT）等生物学功能的调控，阐明肿瘤干细胞在肿瘤转移过程中的详细机制。更重要的是，针对“干性”特征及转移潜能等，从转化医学的角度去发掘可干预的治疗靶点，开发有效的小分子抑制剂等干预方法和手段。 （二）课题设置 本项目将围绕“肿瘤干细胞的动态演进与干预”这个核心，系统研究肿瘤干细胞的动态演进过程、及该过程中“干性”特征和转移潜能的获得机制与临床意义，以干预调控通路、诱导细胞凋亡、阻断代谢途径等为切入点，针对各阶段调控通路中的关键分子，制定干预手段，靶向肿瘤干细胞关键信号传导通路，以期根治肿瘤。本项目设置四个研究课题： 【研究课题一】 从探讨肿瘤干细胞的动态演进模型入手，结合表型、功能和遗传学变异的多样性，准确地鉴定和分离肿瘤干细胞起始和发展各个阶段的细胞，即起源细胞、前肿瘤干细胞和肿瘤干细胞，明确演变过程中各个阶段遗传学和表观遗传学改变，探讨对肿瘤病因学和治疗学的临床意义。（经费比例： 18%）【研究课题二】 应用肿瘤干细胞演变过程中的各阶段细胞、或患者标本中的肿瘤干细胞，进行高通量的测序分析，筛选与干细胞“干性”、凋亡通路、转移特性、代谢调节通路等密切相关的候选分子，开展体内外实验进行功能鉴定及临床标本验证，并收集临床标本验证其临床意义，与此同时发展前期工作基础，挖掘Aurora-A、GSK-3、Bmi-1等分子在肿瘤干细胞“干性”调控方面的具体分子机制。（经费比例：28%）【研究课题三】 应用已有的动物模型，结合体内外转移相关实验，研究筛选到的与肿瘤干细胞转移潜能相关的候选分子，研究 “干性”相关基因调节细胞发生转移及EMT的生物学行为机制。（经费比例：28%）【研究课题四】 结合研究课题一、二、三中得到的肿瘤干细胞演化过程、“干性”调节基因、转移相关基因以及代谢调控基因等为目标，从中寻找可干预的靶点，研发设计特异性的小分子靶向药物、凋亡诱导/增敏剂、抗代谢药物等，以期预防及根除肿瘤。（经费比例：26%）（三）创新点与特色1. 本项目瞄准国际前沿，面向国家需求，针对2011年“干细胞研究国家重大科学研究计划”中“肿瘤干细胞与肿瘤发生、药物抗性及靶向特异性分子调控”的要求，综合利用多学科优势，针对肿瘤干细胞的动态演进过程，及其分子调控网络和相互作用，展开多层面而又互相关联的研究。 2. 本项目将肿瘤干细胞研究的各个领域有机的结合在一起，通过各个子课题的开展，明确肿瘤干细胞演变各个时期的分子调控机制，明确演变过程中各个阶段遗传学和表观遗传学改变，阐明肿瘤干细胞的“动态演进过程”，将引领肿瘤干细胞研究的前沿。 3. 应用新一代高通量测序方法，筛选出肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞之间、肿瘤干细胞发生不同阶段的细胞之间的遗传学和表观遗传学差异关键，发现肿瘤干细胞发生发展过程中的关键分子及信号通路，并且通过体内外的实验和临床标本验证候选分子的重要通路，为后续肿瘤干细胞的研究提供众多切入点。4. 本项目拟开展的肿瘤干细胞“干性”以及转移潜能研究，将揭开肿瘤干细胞自我更新等“干”细胞特征的详细分子调控机制，为靶向肿瘤干细胞干预研究带来新的契机。 5. 本研究将结合各研究方向取得的研究结果，针对肿瘤干细胞的演变过程、“干性”调控和转移机制来研发各种小分子抑制剂等靶向干预手段和方法，为临床应用提供有力的实验依据。 6. 本课题组是由来自华南肿瘤学国家重点实验室（中山大学）、分子肿瘤学国家重点实验室（中国医学科学院）、医药生物技术国家重点实验室（南京大学）、教育部肿瘤相关基因与抗肿瘤药物研究教育部重点实验室（中山大学）以及教育部细胞分化与凋亡教育部重点实验室（武汉大学）的多位精英组成，具有丰富的理论知识与实验经验，将为本项目的顺利实施奠定坚实的基础。（四）可行性分析 1、科学假设的可行性：肿瘤干细胞的生物学特性近年来被广泛研究，应用多种标记分子和不同的分析手段，研究人员在血液系统和多种实体肿瘤中已经得到了相应的干细胞群。学者们也陆续发现肿瘤干细胞在肿瘤发生发展的多个阶段中发挥着重要的作用，如肿瘤转移和耐药的过程等。虽然目前人们在该领域已取得了一定成果，但其动态演进过程、生物学特征、调控机制、治疗靶点等方面仍然存在很多疑问，有待于肿瘤研究领域的科研工作者进一步去探索。 2、资源和技术的可行性：本项目依托的“华南肿瘤学”国家重点实验室 （2004DA105074），具备充足的实验条件完成本项目。承担单位及主要合作单位拥有系统的肿瘤发生发展相关的信号转导通路研究平台、蛋白质分析、蛋白质大规模纯化与复性技术平台；已建立完善的三维细胞培养平台、形成了技术可靠的分子遗传学、分子病毒学、细胞生物学、分子药理学实验技术平台；已建立了成熟的RNA干扰技术以及小鼠荷瘤动物实验模型；具有细胞周期调控中信号通路的研究基础和技术平台；分子相互作用与新药筛选技术平台；生物信息学及结构模拟技术平台、组织芯片研究平台。 3、合作的可行性：项目承担单位中山大学肿瘤防治中心是华南肿瘤学国家重点实验室，合作单位中国医学科学院分子肿瘤学国家重点实验室、南京大学医药生物技术国家重点实验室、教育部肿瘤相关基因与抗肿瘤药物研究教育部重点实验室以及教育部细胞分化与凋亡教育部重点实验室等国内实力雄厚的科研基地，在肿瘤干细胞研究上取得了国际领先的研究成果，并发表了多篇颇有影响力的文章。合作单位之间已建立良好的团队关系，经常进行学术交流活动及学术会面，形成了良好的学术氛围。 4、人才的可行性：本项目成员来自于六所单位（中山大学、中国医学科学院、上海交通大学、南京大学、武汉大学和大连医科大学），均为具有雄厚科研实力的中青年学术带头人，且长期从事恶性肿瘤研究工作、活跃在肿瘤研究工作第一线的学者，研究范围覆盖肿瘤干细胞领域的各个方面，具有丰富的肿瘤干细胞研究经验，将为本项目的顺利开展与实施提供保障。 （四）课题的组织管理方式和机制 本项目承担单位有中山大学、中国医学科学院肿瘤研究所、上海交通大学医学院、南京大学、武汉大学、大连医科大学等六所科研单位。中山大学肿瘤防治中心作为课题第一申请单位，指定课题负责人。中国医学科学院肿瘤研究所、上海交通大学医学院、南京大学、武汉大学和大连医科大为课题合作单位，安排相应的研究力量参加课题研究工作。通过项目的实施，本团队将创新肿瘤干细胞动态演进模型，明确其演变过程中遗传和表观遗传学的关键变化，以及“干性”相关分子调控机制以及在转移与耐药干预等方面取得进展，并凝聚一支高水平的研究团队，培养一批优秀的青年学术骨干。 本项目将通过以下方式来建立合理的管理体系： 1.成立一个团结协作的项目组，首席科学家负责组织、协调、监督各参与单位的研究的工作；项目首席科学家助理负责外联、经费预算、会议安排等工作；2.在课题内设立项目负责人，协调、监督分项骨干的研究进展； 3.项目首席科学家及有关专家定期到实验室检查保证研究的进度及质量；4.每年召开一次课题组工作汇报，由独立的论证专家组评议，聘请国内的肿瘤干细胞及其他肿瘤研究领域专家担任成员，保证和监督课题的完成； 5.根据研究进展和专家评议，监督和引导各课题方向经费的作用； 6.各分题及实验室要保证按期总结结果，以便整个课题能准时汇总上报； 7.承担单位与参加单位在人力、物力及财力等支撑条件上给予充分的保证。四、年度计划研究内容预期目标第一年2012.012012.121. TEL-AML1相关白血病起源细胞的鉴定，阳性前白血病组织的筛选和Pre-LSC的分离鉴定，白血病中各个亚克隆的LSC的鉴定分离； 2. 通过congenic移植途径重建PML-RAR相关前白血病克隆和白血病克隆；3. 建立肝癌干细胞的亚克隆xenograft的移植模型；4. 结合前期工作基础，研究Aurora-A, Bmi-1, GSK-3，Stat5等分子在肝癌、白血病等肿瘤干细胞中的重要作用，并结合运用体内外实验以及临床标本进行验证；5. 收集肝癌患者原代标本，通过表面标记，运用流式细胞仪分选收集CD133+肿瘤干细胞和CD133-的非肿瘤干细胞；6. 通过动物体内试验对肝癌转移模型的转移能力进行鉴定检测；7. 体内培养高转移和低转移细胞、收集Hca-F及Hca-P细胞，利用流式细胞仪进行肿瘤干细胞的分选和鉴定；8. 探究Cyclin B1在KYSE150细胞系中的高表达对sp侧群细胞的影响；9. 对SP侧群细胞的小鼠成瘤能力，耐药性和克隆形成能力以及悬浮培养成球能力等癌干细胞特征进行验证；10. 对SP侧群细胞和肿瘤球细胞进行免疫荧光以及流式细胞术检测一些常用的肿瘤干细胞表面分子Marker在食管癌干细胞中的表达情况为后期干细胞分离建立一定基础；11. 流式细胞术检测Cyclin B1高表达对细胞系肿瘤干细胞的细胞周期的影响；12. 研究Bmi-1、LMP2A等癌基因在恶性肿瘤中与EMT和干细胞的关系；13. 筛选食管癌细胞系,检测MUC1表达情况，建立MUC1基因高表达或MUC1miRNA表达沉默的食管癌细胞系；14. 进行肿瘤干细胞的分选、富集与干性鉴定；检测AKT信号通路、XIAP蛋白在肿瘤干细胞中的表达；15. 研究不同HSP分子对细胞凋亡敏感性的不同调控作用；设计并筛选改善肿瘤干细胞对细胞凋亡敏感性的细胞凋亡诱导药物TRAIL变体；16. 研究ABC转运泵如ABCG2对干细胞干性及数量的影响；ABC转运泵与TKIs交互作用的研究。1. 分离到TEL-AML1相关白血病发病过程中各个时期的干细胞；2. 建立PML-RAR相关前白血病和肝癌的病模型。3. 探讨并发现肿瘤发生发展过程中的重要分子Aurora-A, Bmi-1, GSK-3, Stat5等在肿瘤干细胞发生于维持中的关键角色；4. 成功分离得到白血病发生过程中不同阶段的干细胞：起始细胞、前白血病干细胞和白血病干细胞，为后续工作奠定基础；5. 建立健全在肝癌细胞系和肝癌患者原代标本中分离CD133+干细胞的方法；6. 确肝癌高低转移细胞系作为肿瘤干细胞研究模型的价值；7. 建立临床肿瘤样品库；8.9.10. 在已有的细胞系与前期实验基础上验证：Cyclin B1诱导EMT能促进细胞向干细胞样细胞的生成；11. 明确Bmi-1、LMP2A等在恶性肿瘤中与EMT和干细胞的关系；12. 建立1-2个用于EMT和MUC1研究的食管癌细胞系。13. 阐明AKT的过激活状态， XIAP过表达对维持肿瘤干细胞的干性特征所发挥的重要作用；14. 发现新的调控肿瘤干细胞对TRAIL敏感性的靶点；15. 阐明ABC转运泵与肿瘤干细胞耐药关系；初步阐明ABC转运泵对肿瘤干细胞“干性”的调节作用。16. 发表SCI论文816篇。第二年2013.012013.121. 从转基因表达PML-RARa 的(前)白血病克隆中分选不同发育阶段的干细胞和祖细胞；2. 结合使用全基因组SNP芯片和甲基化芯片方法比较分析上述鉴定分离的起源细胞、pre-LSC和LSC之间的SNP、结构变异和表观遗传变异；3. 结合表型分选、功能验证和遗传变异多样性分析鉴定肝癌干细胞克隆（CD133+）内各个亚克隆的CSC，研究它们之间的演化关系；4. 应用新一代高通量测序方法，检测白血病不同阶段干细胞和肝癌干细胞的全外显子组、全基因组、全miRNA等遗传/表观遗传学变异；5. 分析高通量测序结果，获得单核苷酸改变、小片段插入和缺失、拷贝数改变、染色体重排和微生物感染等基因组信息；6. 在分子水平、细胞水平和动物模型中探讨候选基因在白血病干细胞“干性”，如无限增殖、多向分化、自我更新等生物学特性中的关键作用；7. 通过体外培养，检测CD133+肝癌干细胞的自我更新能力，以及向CD133-细胞的分化能力，探讨调节肿瘤干细胞干性的分子机制与关键调控通路，以期发现肿瘤耐药、复发、转移治疗的新靶点；8. 研究具有转移潜能的肿瘤干细胞的表达谱：以高转移细胞株为模型，对分选出的肿瘤干细胞和非干细胞，采用高通量的芯片技术平台，包括基因表达谱、miRNA谱、蛋白质组学等方法，开展肿瘤干细胞的组学研究；9. 利用分选的SP细胞,检测与EMT相关的Marker的表达情况；10. 利用基因芯片等技术检测与肿瘤干细胞密切相关的microRNA如miR-21，miR-214等在Cyclin B1高表达诱导EMT细胞系与低表达细胞系中的干细胞的表达差异；11. 研究EMT状态下Bmi-1结合靶基因的机制，筛选介导Bmi-1结合到靶基因的转录因子及ncRNAs，进行验证并分析结合序列的序列特征；12. 研究LMP2A介导EMT机制，采用Phage Display筛选与LMP2A特异结合的多肽；13. 研究MUC1高表达细胞系是否呈现EMT相关的形态、功能和标志物改变；14. 从上述细胞系中进行干细胞的分析、分离，研究干细胞的比例及特性；15. 检测2-嘧啶-5-酰胺基噻唑类AKT抑制剂、XIAP小分子抑制剂对肿瘤干细胞增殖及凋亡诱导作用；16. 系统研究改善肿瘤干细胞对凋亡敏感性的细胞凋亡诱导药物TRAIL变体的抗肿瘤谱，进行作用机制研究；构建肿瘤干靶向性细胞凋亡诱导药物TRAIL变体；17. ABC转运泵如ABCB1、ABCB5、ABCs等对干细胞干性及数量的影响；ABC转运泵与TKIs交互作用的研究；18. 比较干细胞与非干细胞的能量代谢途径差异。1. 分离到PML-RARa相关白血病发病过程中各个时期的干细胞；2. 比较分析出所研究白血病起源细胞、pre-LSC和LSC之间的SNP、结构变异和表观遗传变异；3. 鉴定到肝癌各个亚克隆的CSC，绘出它们之间的演化关系。4. 采用新一代高通量方法检测不同阶段白血病干细胞和肝癌干细胞的基因图谱，得到各种遗传学信息；5. 明确不同阶段白血病干细胞的干细胞特性，全面认识白血病干细胞的发生于发展；6. 全面研究CD133+肝癌干细胞的干细胞特性及相关调控通路，发现潜在的治疗靶点；7. 明确具有转移潜能的肿瘤干细胞的表达谱；8. 探讨Cyclin B1在蛋白以及microRNA层次上对肿瘤干细胞的调节作用;9. 鉴定介导Bmi-1结合到靶基因的候选转录因子及ncRNAs；10. 筛选到4-5个LMP2A结合候选多肽； 11. 明确食管癌中，MUC1与肿瘤干细胞以及EMT发生的关系。12. 阐明2-嘧啶-5-酰胺基噻唑类AKT抑制剂和XIAP小分子抑制剂对肿瘤干细胞的增殖抑制作用；13. 筛选获得改善肿瘤干细胞对凋亡敏感性的细胞凋亡诱导药物；14. 阐明ABC转运泵与肿瘤干细胞耐药关系；阐明ABC转运泵对肿瘤干细胞“干性”的调节作用；15. 阐明肿瘤干细胞能量代谢中的关键分子通路。16. 发表相关SCI论文1020篇，发现肿瘤干细胞靶点23个。第三年2014.012014.121. 综合分析遗传学和表观遗传学信息结果，提出调控LSC/CSC的关键分子为项目课题二和四提供信息；2. 利用移植（xenograft 或syngenic）的（前）白血病模型研究TEL-AML相关白血病干细胞的动态演进过程；3. 利用congenic移植模型研究PML-RAR相关白血病起始和发展过动态演进过程；4. 用xenograft模型观察肝癌干细胞亚克隆的形成过程。5. 绘制基因序列、表达图谱，表观遗传学谱，筛选与“干性”调节等密切相关的候选分子标记；6. 运用分子、细胞水平实验，检测候选分子在白血病干细胞“干性”特征维持中的关键作用；7. 建立动物模型，在动物体内验证候选分子的作用；8. 采用Real-time PCR、免疫组化（tissue arry）和蛋白质印迹等方法，对可信度高的差异基因或蛋白质进行验证；9. 确证细胞水平上的研究结果，筛选重要的基因、蛋白进行下一步机制的研究；10. 利用裸鼠模型验证该基因在体内促进肿瘤细胞侵袭、转移的能力；11. 比较Cyclin B1高表达细胞系肿瘤干细胞中与ips密切相关基因如Oct4、Nanog等的变化，利用甲基化基因芯片检查该类基因的启动子的甲基化的变化，以检测Cyclin B1高表达能否增加癌细胞诱导多能干细胞的能力，即Cyclin B1诱导的EMT能否增加细胞向多能性干细胞的转化；12. 利用siRNA技术探讨敲降Oct4、Nanog以及与干细胞干性维持相关基因能否阻断或逆转Cyclin B1诱导的EMT；13. 研究转录因子和ncRNAs介导Bmi-1结合靶基因的机制，探讨EMT状态下这些因子的调控特征；14. 研究LMP2A结合多肽靶向LMP2A的特异性；寻找MUC1高表达细胞与基因沉默细胞系中与侵袭、转移能力相关的基因表达差异和信号通路；15. 探讨2-嘧啶-5-酰胺基噻唑类AKT抑制剂、XIAP小分子抑制剂对肿瘤干细胞的抗瘤分子机制。16. 明确改善肿瘤干细胞对凋亡敏感性的细胞凋亡诱导药物TRAIL变体1的疗效及作用机制；肿瘤靶向性细胞凋亡诱导药物TRAIL变体2s设计和性质研究；17. ABC转运泵与其他“干性”分子交互作用的研究；TKIs能诱导肿瘤细胞基因突变导致肿瘤干细胞产生，对TKIs耐药细胞是否就是肿瘤干细胞或富含肿瘤干细胞；18. 通过体内外实验评价糖酵解抑制剂对干细胞的特异性杀伤作用。1. 弄清所研究白血病干细胞克隆性演化的分子机制，为肿瘤干细胞干性研究（项目课题2）和靶向干预研究（项目课题4）提供信息支持；2. 观察到LSC/CSC的动态演化和亚克隆形成过程；3. 建立肝癌干细胞、白血病干细胞的基因序列图谱、表达图谱以及表观遗传学图谱，得到“干性”相关候选分子；4. 系统展开分子、细胞、动物水平实验，发现候选分子的“干性”相关重要功能以及调控的关键信号通路；5. 明确肿瘤干细胞调控通路中的关键分子； 6. 探讨诱导EMT促进干细胞样细胞的生成的可能机制；7. 明确介导Bmi-1结合到靶基因的候选转录因子或ncRNAs；8. 明确1-2个LMP2A结合候选多肽；9. 利用动物模型，验证MUC1高表达细胞系转移潜能，研究MUC1参与促进EMT过程的可能性及其机制；10. 阐明2-嘧啶-5-酰胺基噻唑类AKT抑制剂，XIAP小分子靶向干细胞的分子机制；11. 明确改善肿瘤干细胞对凋亡敏感性的凋亡诱导药物的作用效果及作用机制；12. 阐明ABC转运泵与“干性”分子的协同作用，诱生肿瘤干细胞；阐明干细胞耐药的多重机理；为TKIs能否诱生肿瘤干细胞提供依据；13. 明确糖酵解抑制剂对肿瘤干细胞的特异性杀伤作用；14. 发表SCI论文1020篇，发现肿瘤干细胞作用靶点24个,申请专利23个。第四年2015.012015.121. 功能性验证前面在白血病和肝癌研究发现的克隆性演化机制；2. 研究ANXA3和CHD1L维持肝癌各个亚克隆CSC的干性的机制；3. 研究MMP10在亚克隆肝癌EMT形成中的作用和机制；4. 收集临床肝癌、白血病标本，验证候选分子的关键作用；5. 以转化医学为出发点，探讨可用于肿瘤治疗的潜在靶点，深入寻找相关的小分子抑制剂/促进剂，尝试清除肿瘤干细胞的新方法；6. 选取前期实验发现的1-2种重要的基因：建立该基因或miRNA高表达的细胞系；研究上述细胞系是否呈现EMT相关的形态、功能和标志物改变；从上述细胞系中进行干细胞的分析、分离，研究干细胞的比例及特性；利用裸鼠模型验证该基因在体内促进肿瘤细胞侵袭、转移的能力；采用shRNA技术，特异性沉默目标基因，重复实验；7. 在组织中用免疫组化的方法检测高侵袭转移肿瘤组织与低侵袭转移肿瘤组织中重点研究蛋白的表达情况;8. 对转录因子-Bmi-1-靶基因的功能筛选和研究，以及对ncRNAs-Bmi-1-靶基因的功能研究和筛选;9. LMP2A结合多肽对EMT和干细胞的调控；10. 采用shRNA技术，特异性沉默目标基因，研究MUC1影响肿瘤干细胞及导致肿瘤转移的分子机制。11. 建立肿瘤干细胞NOD/SCID小鼠成瘤模型，检测2-嘧啶-5-酰胺基噻唑类AKT抑制剂、XIAP小分子抑制剂对肿瘤干细胞种植能力的影响，对移植瘤及肿瘤干细胞的抑制作用；12. 发现调控肿瘤干细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感性的药物靶点及其作用机制研究；肿瘤靶向性细胞凋亡诱导药物TRAIL变体的抗肿瘤疗效评价；13. ABC转运泵与其他“干性”分子交互作用的研究；TKIs靶向信号分子及信号通路调节ABC转运泵表达及其他“干性”信号分子的表达，从而调节肿瘤细胞表型；14. 研究糖酵解抑制剂对肿瘤干细胞的特异性杀伤作用的分子机制。1. 用功能研究验证分子机制，提炼出关键的细胞靶点和分子靶点；2. 形成有普遍意义的肿瘤干细胞模型和理论；3. 在临床标本中证明候选分子在肿瘤以及肿瘤干细胞发生发展中的重要作用；4. 发现关键分子相关的调控通路，获得潜在的肿瘤治疗靶点；5. 明确参与调节肿瘤干细胞干性的基因促进EMT过程的可能性及其机制；6. 明确与细胞增殖相关的基因调节EMT及肿瘤干细胞生物学行为的机制；7. 对组织切片进行EMT指标与干细胞的干性指标的双重鉴定以期找到两者的相关性；8. 确定EMT/干性有关的转录因子-Bmi-1-靶基因，确定EMT/干性有关的ncRNAs-Bmi-1-靶基因