蛋白质表征技术.ppt

蛋白质表征技术 1蛋白质的基本概念 蛋白质 protein 是生命的物质基础 是有机大分子 是构成细胞的基本有机物 是生命活动的主要承担者 没有蛋白质就没有生命 氨基酸是蛋白质的基本组成单位 蛋白质不仅在功能上与糖 脂肪不同 在元素组成上亦有差别 根据蛋白质的元素分析表明 其元素组成依次为 碳 50 55 氧 19 24 氮 13 19 氢 6 7 硫 0 4 有的还含有少量磷 铁 铜 锌 锰 钴 钼 碘等元素 一切蛋白质皆含有氮并且大多数蛋白质含氮量比较接近而恒定 一般为15 17 平均为16 这是蛋白质元素组成的一个重要特点 也是各种定氮法测定蛋白质含量的计算基础 即用定氮法测得的含氮量乘以6 25 即可算出样品中蛋白质的含量 但有的蛋白质中氮的含量有一定差别 应根据其氮的真实含量进行计算 2蛋白质的元素组成 3 1氨基酸的结构自然界的氨基酸超过300种 但是组成人体蛋白质的氨基酸有20种 可以看作是羧酸分子中 碳原子上的氢原子被氨基取代而成的化合物 均属于 氨基酸 即其氨基和羧基都连接在 碳原子上 氨基酸碳链表示 其结构可用下列通式表示 注 R代表不同的侧链基团 R不同代表不同的氨基酸 3蛋白质结构的基本单位 氨基酸 各种氨基酸在结构上有下列共同特点 组成蛋白质的氨基酸皆为 氨基酸 不同的 氨基酸 其R侧链不同 氨基酸分类的依据 它对蛋白质的空间结构和理化性质有重要的影响 除R侧链为氢原子的甘氨酸外 其它氨基酸的 碳原子所连接的四个原子或基团互不相同 该碳原子都是不对称碳原子 20种氨基酸中的脯氨酸含有亚氨基 所以它是亚氨基酸 半胱氨酸在蛋白质分子中多数是以胱氨酸的形式存在 3 2氨基酸的分类根据侧链R基团的结构和性质进行分类 1 酸性氨基酸 谷氨酸Glu和天冬氨酸Asp其R基团含羧基 在pH7时 羧基可解离而使分子带负电荷 游离或在蛋白质中都带负电荷 以酸根形式存在 在蛋白质中与正电基团形成盐键 2 碱性氨基酸 赖氨酸Lys 精氨酸Arg和组氨酸His其R基团含碱性基团 在pH7时 这些基团可质子化而使分子带正电荷 3 非极性疏水性氨基酸其R基团无极性 不解离 且为疏水性的 4 不解离的极性氨基酸 极性非电离氨基酸 羟基氨基酸 巯基氨基酸 甘氨酸其R基团虽有极性但不能解离 5 蛋白质中少见的氨基酸 无遗传密码 来自翻译后加工修饰 3 3氨基酸的理化性质3 3 1两性解离及其等电点氨基酸是两性电解质 氨基酸既含羧基 又含氨基 同时能起酸和碱的作用 是两性电解质 在水溶液中主要以兼性离子 偶极离子 的形式存在 氨基酸的等电点 在某一pH的溶液中 氨基酸解离成阴 阳离子的趋势和程度相等而成为兼性离子 呈电中性时溶液的pH称为该氨基酸的等电点 isoelectricpoint pI 3 3 2紫外吸收性质20种氨基酸在可见光区无吸收 在远紫外区 220nm都有光吸收 在近紫外光区 220 300nm 只有苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸有吸收 色氨酸 酪氨酸的最大吸收峰都在280nm附近 由于大多数蛋白质中含有色氨酸和酪氨酸残基 所以可以测定蛋白质溶液的280nm的光吸收值对蛋白质进行定量分析 3 3 3茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热生成蓝紫色化合物 在570nm处有最大吸收峰 可以作为定量测定氨基酸的方法 4 1肽键一个氨基酸的 羧基与另一个氨基酸的 氨基脱水缩合形成的共价键 CO NH 称为肽键 又称酰胺键 蛋白质分子中的氨基酸通过肽键连接 4肽 4 2肽氨基酸通过肽键连接起来的化合物称为肽 4 3氨基酸残基 residue 氨基酸在形成肽链后 因有部分基团参加肽键的形成 已经不是完整的氨基酸 故将蛋白质肽链中的每个氨基酸部分称为氨基酸残基 每一个氨基酸残基上都有一个R侧链 不同R侧链有不同的性质和功能 多肽链有两端 具有游离 氨基的称为氨基末端 N 末端 aminoterminal 通常写在肽链的左端 具有游离 羧基的称为羧基末端 C 末端 carboxylterminal 常写在肽链的右端 多肽链的方向从N 端到C 端 肽链也是从N 端到C 端按氨基酸残基的顺序来命名的 N端测序几乎所有的蛋白合成都起始于N 端 蛋白质N 端的序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着巨大的影响力 例如N 端序列影响蛋白质的半衰期 同时关联着蛋白亚细胞器定位等 这些与蛋白的功能和稳定性息息相关 对蛋白进行N 端测序分析 有利于帮助分析蛋白质的高级结构 揭示蛋白质的生物学功能 方法 目前对蛋白N端测序主要分类两大类 其一为非质谱技术 例如经典的Edman降解法 利用反转录RT PCR得到对应蛋白的cDNA 再来反推得到蛋白序列 其二为质谱技术 各自都有其使用的长处和制约之处 目前 市面上采用的 依然是基于经典的Edman降解法原理 利用美国ABI公司Procise491蛋白序列测序系统进行蛋白N 端测序 原理 Edman化学降解 其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N 端残基的偶联 苯氨基硫甲酰酞 PTC 肽 环化裂解 和噻唑呤酮苯氨 ATZ 转化为苯异硫尿氨基酸 PTH 氨基酸 三个主要的化学步骤 每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基 同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个Edman降解 最后通过转移的PTH 氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定 C端测序众所周知 C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位 对蛋白质的生物功能甚至起决定性作用 此外 由于蛋白翻译后在细胞内需要进一步剪切和修饰 通常不能简单的使用基因序列对C 端或N端做简单的预测 对于蛋白生物制品来说 使用C 端测序必不可少 随着蛋白质组学研究的不断深入 蛋白质C端测序对其功能研究将发挥越来越重要的作用 一些新的蛋白质C端测序方法已建立 提高了灵敏度和重复性 能够在蛋白质组水平应用 方法 羧肽酶法 化学法及串联质谱法 目前 使用较多的是利用串联质谱法 其原理为利用蛋白质在质谱中有规律的破碎 获得蛋白质肽段的碎片 分析图谱得到蛋白质的C 端序列 5 1稳定蛋白质的作用力蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的 具有特定分子结构的高分子化合物 蛋白质的分子结构可人为划分为一 二 三 四级结构 除一级结构外 蛋白质的二 三 四级结构均属于空间结构 即构象 蛋白质的构象通常由非共价键 次级键 来维系 5蛋白质的三维结构 5 2蛋白质的结构蛋白质分子内各个原子之间相互的立体关系就是蛋白质分子的结构 通常将蛋白质的结构分为一级结构 二级结构 三级结构和四级结构 5 2 1蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 又称为初级结构或化学结构 是指蛋白质分子中 由肽键连接起来的各种氨基酸的排列顺序 每种蛋白质都有唯一而确切的氨基酸序列 一级结构的主要化学键是肽键 有些还包括二硫键 S S 因共价键的键能大 故蛋白质的一级结构稳定性较强 蛋白质的一级结构包括 组成蛋白质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序 多肽链内和链间二硫键的数目和位置 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序 它是蛋白质生物功能的基础 测定蛋白质一级结构的主要意义 一级结构是研究高级结构的基础 可以从分子水平阐明蛋白质的结构和功能的关系 可为生物进化提供理论依据 可为人工合成蛋白质提供序列参考 目前可以运用氨基酸自动分析仪和质谱对蛋白质的一级结构进行测定 氨基酸序列分析一般采用综合的方法测定目标制品的氨基酸序列 并与其基因序列推断的理论氨基酸序列进行比较 自动序列分析仪测序其原理为Edman降解法 分为耦合 切割 萃取 转化 鉴定等几个步骤 首先在pH9 0的碱性环境下 将异硫氰酸苯酯 Ph N C S PITC 和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合 形成苯氨基硫甲酰 PTC 衍生物 然后以三氟乙酸 TFA 处理耦合后产物 将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断 释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物 随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸 PTH 氨基酸 最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH 氨基酸种类 从而得到蛋白质或多肽N端序列信息 质谱技术质谱所使用的测序方法是denovo测序 是根据肽段与惰性气体相碰撞产生的一系列的有规律的片段离子之间的质量差来推断氨基酸序列 我们可以根据肽键断裂处的y离子和b离子来推测氨基酸序列从而不受翻译后修饰和纯度的限制 但是质谱测序是有局限性的 1 质谱测序依赖于公共数据库 如果所研究的物种的基因组没有完全被测序 或者其中部分没有对应的序列 那么质谱测序将无法得出正确的鉴定 2 我们使用的搜索引擎的打分和算法可能也会使得我们遗漏一部分的肽段和质谱图的匹配 产生假阳性结果 3 如果有点突变或者未知修饰存在的话 由于搜库算法或者参数设置中没有考虑到 同样也无法得出正确的结果 质谱技术还广泛用于蛋白质的纯度鉴定 分子质量测定 肽 质 谱分析 二硫键 乙酰化 糖基化 磷酰化 以及非共价结合等 5 2 2蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 是指蛋白质分子中多肽链本身的折叠方式 形成蛋白质二级结构基础的是肽单元或肽键平面 蛋白质的二级结构主要依靠氢键来维持结构的稳定性 常见的二级结构元件 螺旋 折叠 转角 凸起无规则卷曲 鉴定方法 常用圆二色谱法 Circulardichroism CD 圆二色谱法圆二色光谱仪通过测量生物大分子的圆二色光谱从而得到生物大分子的二级结构 当平面偏振光通过具有旋光活性的介质时 由于介质中同一种旋光活性分子存在手性不同的两种构型 故它们对平面偏振光所分解成的右旋和左旋圆偏振光吸收不同 从而产生圆二色性 远紫外的圆二色谱可用来测定蛋白质的二级结构 近紫外的圆二色谱可用来检测蛋白质侧链的三级结构 应用 蛋白质折叠 蛋白质构象研究 DNA RNA反应 酶动力学 光学活性物质纯度测量 药物定量分析 天然有机化学与立体有机化学 物理化学 生物化学与宏观大分子 金属络合物 聚合物化学等相关的科学研究 5 2 3蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 是指具有二级结构的肽链 按照一定方式再进一步卷曲 盘绕 折叠成一种看来很不规则 而实际上有一定规律性的三维空间结构 维系三级结构的化学键主要是非共价键 次级键 如疏水作用 氢键 盐键 范氏引力等 但也有共价键 如二硫键等 5 2 4蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 具有三级结构的蛋白质分子 通过一些非共价键结合起来 而成为具有生物功能的蛋白质大分子 就是蛋白质的四级结构 亚基 是指参与构成蛋白质四级结构的 每条具有三级结构的多肽链 亚基虽然具有二 三级结构 但是在单独存在时并没有生物活力 只有完整的四级结构才具有生物活力 维系蛋白质四级结构的是氢键 盐键 范氏引力 疏水作用等非共价键 血红蛋白空间结构 蛋白质高级结构的实验解析方法 蛋白质结构实验分析主要有三大技术平台 1 X 衍射蛋白质晶体结构分析 2 核磁共振波谱分析 3 冷冻电镜技术 蛋白质晶体结构X 衍射分析 摸索蛋白质结晶条件 快速处理晶体结构数据和减少差错是目前蛋白质晶体结构分析的两大难题或瓶颈 是目前分辨率最高的结构测定方法 高通量晶体结构分析中的几大重要环节是 数据处理与分析 重原子的定位 密度修饰 分子替换 图形整合 模型加工和确认 晶体结构分析的常用软件有SOLVE RESOLVE等 核磁共振波谱分析 利用核磁共振原理 检测分子质量小于60k 的蛋白质 通过对其核磁共振谱线特征参数的测定来分析蛋白质的结构与性质 就是将原始资料利用傅里叶变换转换为不同的峰值 然后采集各种不同的峰组成图谱 并利用生物信息学方法筛选出具有特定结构特征的图谱 常用NMRPipe和SPARKY软件处理这些过程 使用XEASY DYANA和GARANT等软件分析侧链或骨架结构 冷冻电子显微镜技术 采用高压快速液氮冷冻方法使样品包埋在玻璃态的水环境中 使我们能够观察到生物大分子在天然状态下的结构 同时冷冻的速度极快 把细胞在其生理活动的某些特定时刻固定下来 显示此时的结构特点 进而可通过不同功能状态的瞬时构象变化来研究生物分子的功能 冷冻电镜获得的是处于天然状态下未经染色的分子的二维投影像 将样品进行不同角度的倾斜所获得的数据进行综合分析 并依据样品的不同特性使用不同的重构技术获得分子的结构 在此基础上观察多种成分的图像变化 追踪生物大分子的装配及其动力学过程 蛋白质结构的可视化 可视化分析蛋白质的高级结构 有利于从原子间相互作用的层次理解生命活动过程的信息控制机制 更加有效地揭示分子在完成其功能过程中的演化情况 了解蛋白质分子结构和各种微观性质与宏观性质之间的定量关系 只要安装蛋白质分子图形学软件 并获得所需蛋白质结构数据 配以商业软件或免费的小分子图形设计系统 就可开展结构生物信息学的探索性工作 6 1两性和等电点蛋白质是由 氨基酸通过肽键构成的高分子化合物 在蛋白质分子中存在着氨基和羧基 因此跟氨基酸相似 蛋白质也是两性物质 等电点 isoe1ectricpoint pI 当蛋白质处于某一pH值的溶液中时 蛋白质分子上所带的正 负电荷相等 净电荷为零 蛋白质为兼性离子 此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点 isoe1ectricpoint pI 等电点是蛋白质的特征常数 各种蛋白质有各自的等电点 当蛋白质所处环境的pH大于pI 等电点 时 蛋白质分子带负电荷 pH小于pI时 蛋白质带正电荷 pH等于pI时 蛋白质所带净电荷为零 此时溶解度最小 等电点检测方法 毛细管电泳法 等点聚焦电泳 6蛋白质的理化性质 6 2水解反应蛋白质在酸 碱或酶的作用下发生水解反应 经过多肽 最后得到多种 氨基酸 蛋白质水解时 应找准结构中键的 断裂点 水解时肽键部分或全部断裂 举例 Edman降解法测定蛋白质的氨基酸顺序 但该法一次只能降解几十个氨基酸残基 因此利用蛋白质的水解性质将蛋白质水解为一些小肽段 分别进行测序 最后进行拼接 获得蛋白质的氨基酸顺序 6 3胶体性质有些蛋白质能够溶解在水里 例如鸡蛋白能溶解在水里 形成溶液 蛋白质的分子直径 1 100nm 达到了胶体微粒的大小 所以蛋白质具有胶体的性质 在蛋白质表面有亲水基团 能与水发生水合作用 水分子受蛋白质极性基团的影响 定向排列在蛋白质分子的周围 形成水化层 将蛋白质颗粒分开 不致相聚而沉淀 蛋白质在偏离等电点的溶液中 形成电荷层 同性电荷相斥 防止蛋白质颗粒相聚沉淀 6 4沉淀原因 加入高浓度的中性盐 加入有机溶剂 加入重金属 加入生物碱或酸类 热变性 盐析 向蛋白质水溶液中加入浓的无机盐溶液 可使蛋白质的溶解度降低 而从溶液中析出 这种作用叫做盐析 盐析出的蛋白质仍旧可以溶解在水中 而不影响原来蛋白质的性质 因此盐析是个可逆过程 利用这个性质 采用分段盐析方法可以分离提纯蛋白质 不同的蛋白质其性质不同 耐受酸 碱 盐 重金属等的程度也不同 因此我们再对纯化工艺获得的蛋白质进行检测时应充分了解该蛋白质的相关性质及缓冲成分 保证检测任务顺利进行 6 5变性蛋白质的变性 是指蛋白质在某些理化因素影响下 其特定空间结构破坏而导致理化性质改变和生物学活性丧失的现象 蛋白质变性的物理因素有 高温 高压 超声波 紫外线 X射线等 蛋白质变性的化学因素有 强酸 强碱 浓乙醇 重金属 尿素 去污剂等 蛋白质变性的本质 蛋白质变性只破坏二硫键和次级键 而不涉及肽键的断裂 因此一级结构并未破坏 蛋白质变性后性质的改变 溶解度降低 粘度增加 结晶能力消失 生物活性丧失 容易被蛋白酶水解 容易沉淀 Gly SDS PAGE 还原性 SDS PAGE 还原剂为DTT或巯基乙醇 样品需煮沸 高级结构破坏 一级结构未被破坏 非还原性SDS PAGE 不含还原剂 但含有SDS 样品不需煮沸 检测蛋白质是否存在二硫键或多聚体 也可简单判断蛋白质是否复性成功 Native PAGE 是在不加入SDS 巯基乙醇等变性剂的条件下 对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰氨凝胶电泳 在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性和构像 为什么蛋白质纯度检测用非还原性电泳 应用 如在临床上用高温 高压 紫外线 75 酒精消毒就是利用了这些变性因素使细菌 病毒的蛋白质变性 从而失去致病作用 在蛋白质的制备过程中 如果提取的目的蛋白是热稳定的 可利用热变形的方法很方便的除去其它杂蛋白 而对于不利的变性则应该尽量避免 蛋白质的复性 是指有些蛋白质变性后 如果设法将变性因素除去 该变性蛋白质尚能恢复其空间结构与活性 利用蛋白质的复性特征可对包涵体蛋白质进行变性 复性纯化 例如在包涵体蛋白质纯化过程中常用尿素或盐酸胍对包涵体进行溶解 纯化获得目的蛋白后 再通过透析除去变性剂 尿素 盐酸胍 巯基乙醇等 或通过稀释减少变性剂的含量 则其特定的氨基酸顺序重新卷曲 折叠成原来的天然构象 酶的活性也恢复到原来的水平 检测复性成功的方法 非还原性电泳 生物活性检测 结构确认 6 6呈色反应蛋白质分子中 肽键及某些氨基酸残基的化学基团 可与某些化学试剂反应显色 称为蛋白质的呈色反应 利用这些呈色反应可以对蛋白质进行定性和定量分析 6 7蛋白质的紫外吸收性质这要来自酪氨酸和色氨酸对于280nm紫外光的吸收 可以对蛋白质进行定性和定量分析 蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术 是确定蛋白质产品的是与非的问题 尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要 研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口 然后根据它的基本性质进行分离纯化 最终用纯品对其进行分析鉴定 如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚 工作起来将会困难重重 因此 蛋白质研究技术首先要对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定 蛋白质分子是非常复杂的生物大分子 能代表其特征参数很多 但在普通实验室能够进行测定的 最常用的参数 归纳起来主要有以下几种 蛋白质的质量鉴定 分子量 蛋白质带电性鉴定 等电点 蛋白质结构鉴定 一二级结构 晶体结构 肽谱 N和C 末端 蛋白质生物学功能鉴定 生物活性 比活 酶促动力学 免疫学鉴定 抗原 抗体反应 酶联免疫反应 7蛋白质的表征 7 1蛋白质的纯化蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点 蛋白质的来源是多样的 主要来自动物 植物的各种组织和微生物 取材要采用含量丰富的器官 抽提蛋白质的第一步是将组织粉碎 破坏细胞 以便于抽提出蛋白质 第二步就是对抽提出来的蛋白质进行纯化 7 1 1几种常见的细胞破碎方法 1 机械方法1 捣碎发 2 研磨法 3 匀浆法 2 物理方法1 温差法 2 压差法 3 生物化学方法1 采用化学试剂甲苯 丙酮 氯仿 Triton等通过化学渗透使细胞内含物选择性的渗透出来 2 自溶法 3 酶解法 7 1 2蛋白质的纯化方法7 1 2 1将多组分蛋白质变为单一组分蛋白质根据蛋白质的分子形状和分子质量大小 电离性质 溶解度和疏水性 生物功能专一性等 常用有各种盐析法 超离心沉降 结晶 电泳 凝胶过滤 离子交换层析 亲