HPLC法测定金银花颗粒中黄芩苷的含量.doc

HPLC法测定金银花颗粒中黄芩苷的含量 组长：修远 组员：王赛飞 郝运 刘麟 季鹏 孙硕 王赛飞 郝云 找文献和实验相关资料修远 季鹏 做实验孙硕 刘麟 准备和 清理实验用具【摘要】 目的：建立金银花颗粒中黄芩苷的的含量测定方法。方法：采用Phenomenex Synergi C18 (4.6250 mm，4 m) 为色谱柱，以甲醇0.1磷酸溶液(47：53)为流动相，280 nm为检测波长，柱温为30 。结果：黄芩苷浓度在0.00308-0.308mgmL-1范围内线性关系良好（r =0.999946），平均回收率为99.3%，RSD=2.1 %。结论：该方法简便、准确，分离度好，可用于金银花颗粒的质量评价。【关键词】 金银花颗粒；黄芩苷；HPLC 前言 金银花颗粒是伤寒论中经典方金银花汤的现代制剂，主要成分为柴胡、黄芩、甘草、党参等七味药材，具有解表散热、疏肝和胃等功效，用于寒热往来、胸胁苦满、心烦喜吐、口苦咽干，其临床运用非常广泛。柴胡、黄芩都是方中主药，由于目前无法提供柴胡对照品，故本文重点对黄芩进行分析并建立其含量测定的方法。文献报道金银花颗粒的含量测定主要采用高效液相色谱法测定黄芩中黄芩苷的含量，为有效控制产品质量，本文建立了高效液相色谱法测定金银花颗粒中黄芩苷的含量，本方法效果良好，定量准确，快速。1、仪器、试剂、试药、对照品、供试品1.1仪器 高效液相色谱仪（安捷伦1100液相色谱仪系统（四元泵）；岛津UV2450。1.2试剂 甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。1.3对照品 黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110715200212，含量测定用）。1.4供试品 由学校提供（批号：20100303）。2、 色谱条件与系统适用性试验2.1色谱条件 2.1.1检测波长的选择根据测定成分黄芩苷的光谱，在近280nm处有最大吸收，故选择检测波长为280nm。仪器性能仪器型号：UV-2450狭缝宽：0.2nm光谱扫描参数设置 扫描范围：200.00至500.00nm 采样间隔：0.2nm 扫描速度：中 2.1.2流动相的选择 根据参照中国药典2010年版一部标准及试验数据（见耐用性项下），流动相为甲醇0.1磷酸溶液(47：53)时，对照品样品有很好的分离度，峰形良好，符合要求。2.1.3色谱条件与系统实用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇0.1磷酸溶液(47：53)为流动相；检测波长为280nm；进样量10l；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000； 对照品溶液的制备：取黄芩苷7.7mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得0.308mg/ml对照品储备液，精密量取对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得0.0308mg/ml的对照品溶液。供试品溶液的制备：取装量差异下的本品，研细，取约3克，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，即得。测定方法：精密量取对照品溶液和供试品溶液各10注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。1 色谱柱的分离度和理论板数、拖尾因子取黄芩苷对照品和供试品各进样10l，按上述色谱条件进行测定，分离度均大于1.5，理论板数达到3000以上，拖尾因子1.03左右，符合要求。2 重复性精密吸取黄芩苷对照品溶液（0.0308mg/ml），测定6次，结果（见表1）表明，重复性试验RSD为0.19%，符合要求。表1 重复性试验结果测定次数123456平均值对照品峰面积1049.71045.11048.31050.71047.41046.81048.03、方法学考察3.1 精密度取同一批号20100303供试品6份，照试验所得方法测定。结果（见表2）表明，重复性试验RSD为0.71%， 符合要求。表2 供试品重复性试验结果测定次数123456平均值黄芩苷mg/袋33.633.233.533.433.933.433.53.2 专属性照上述色谱条件，吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10l，分别注入液相色谱仪。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照色谱在此保留时间处无吸收峰，说明处方中其它成分对黄芩苷测定无干扰。空白阴性对照溶液制备：按处方比例缩小10倍，除去黄芩苷，照工艺方法制备。3.3 线性精密量取上述0.308mg/ml对照品储备液1ml置100ml量瓶中，同时再取1ml、2ml、4ml、8ml分别置10ml量瓶中，加甲醇溶解至刻度，依次得浓度为0.00308mg/ml、0.0308mg/ml、0.0616mg/ml、0.1232mg/ml、0.2464mg/ml对照品溶液。精密吸取上述浓度的对照品溶液和0.308mg/ml对照品储备液各10l，注入液相色谱仪，测定峰面积。以黄芩苷对照品色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，黄芩苷浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，见下表3。线形回归方程Y=34102.6X31.1，r0.999946。线形范围为0.00308mg/ml0.308mg/ml。浓度mg/ml0.003080.03080.06160.12320.24640.308平均峰面积95.41033.52061.64146.48305.810534.9RSD%1.78%0.16%0.14%0.11%0.33%0.35%线形回归方程Y=Kx+b相关系数r=0.99994592斜率k=34102.62189截距-31.07582133.4 准确度（加样回收试验）取已知含量（20100303：33.6mg/袋，0.336%）的供试品6份，精密加入黄芩苷对照品，按试验所得方法测定，结果表明，该分析方法的回收率为97.4%102.5%，平均回收率为99.3%，RSD为2.09%，符合要求。（见表4）表4 加样回收结果试验梯度取样量（g）样品含黄芩苷理论含量（mg）对照品加入量（mg）实际测得总量（mg）回收率（%）100%1.50255.04845.09.9798.4%100%1.50135.04435.010.17102.5%100%1.50245.04815.09.9297.4%100%1.50475.05585.09.9698.1%100%1.50805.06695.010.13101.3%100%1.50135.04445.09.9598.1%计算式： 实测量mg供试品理论值mg回收率 100 对照品加入量mg3.5 耐用性3.5.1 供试品提取溶剂的选择（表5）试验次数提取溶剂黄芩苷含量（%；mg/袋）1甲醇0.317%；31.7 mg/袋295%乙醇0.308%；30.8 mg/袋370%乙醇0.336%；33.6mg/袋445%乙醇0.256%；25.6 mg/袋从表中看出，根据不同溶剂提取效率及安全性，选用70%乙醇适宜为供试品的提取溶剂。3.5.2 供试品提取方式及时间取同一批号的供试品3份，以70%乙醇为溶剂，考察供试品提取方式及时间对测定结果的影响。根据考察结果（见表6），确定供试品提取方式及时间为超声提取30分钟，即可。试验次数提取时间黄芩苷含量（%；mg/袋）1超声15min0.285%；28.5 mg/袋2超声30min0.336%；33.6 mg/袋3超声45min0.338%；33.8 mg/袋4回流1h0.290%；29.0 mg/袋5回流2h0.294%；29.4 mg/袋3.5.3 柱温（见表7）试验次数温度黄芩苷含量（%；mg/袋）1250.327%；32.7 mg/袋2300.336%；33.6 mg/袋3350.328%；32.8 mg/袋3.5.4 流速（见表8）试验次数流速ml/min黄芩苷含量（%；mg/袋）10.80.330%；33.0 mg/袋210.336%；33.6 mg/袋31.20.338%；33.8 mg/袋3.5.5 不同色谱柱的比较（见表9）试验次数色谱柱黄芩苷含量（%；mg/袋）1Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A(4.6250mm，4um)0.336%；33.6 mg/袋2HanBang Phecda-C18(4.6250mm，5um)0.325%；32.5 mg/袋3SHIMADZU VP-ODS C18(4.6150mm)0.342%；34.2 mg/袋3.5.6 流动相比较（见表10）试验次数流动相组成及比例黄芩苷含量（%；mg/袋）1甲醇0.1磷酸溶液(47：53)0.336%；33.6 mg/袋2甲醇0.2磷酸溶液(47：53)0.334%；33.4 mg/袋3甲醇0.4磷酸溶液(47：53)0.338%；33.8 mg/袋3.6 稳定性试验取同一批号为20100303供试品溶液，分别于0、2、5、10、15、20、24小时各进样10l，按上述色谱条件进行测定。测得其峰面积值分别为6792、6795、6758、6789、6757、6780、6712，平均值6769，RSD为0.43%，结果表明，在24小时内供试品溶液中的黄芩苷是稳定的。4、样品含量测定照上述试验方法，对三批样品进行测定，结果见表11表11含量测定结果批号 黄芩苷含量（，mg/袋）201003010.331%；33.1 mg/袋201003020.329%；32.9 mg/袋201003030.337%；33.7 mg/袋5、讨论5.1本实验经过重复性、精密度、专属性、线性、准确度、耐用性、稳定性等实验，数据偏差均符合规定，其实验条件基本稳定。5.2 在耐用性试验中，柱温、流速、不同的色谱柱对金银花颗粒中黄芩苷的含量测定影响不大，在流动相的选择时，甲醇0.1磷酸溶液(47：53)，甲醇0.2磷酸溶液(47：53)，甲醇0.4磷酸溶液(47：53)对黄芩苷的测定也无较大影响，出于对柱子的保护（大多数柱子的pH为2-8），故选择甲醇0.1磷酸溶液(47：53)作为流动相。相关文献：HPLC高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。高效液相层析仪根据各种各样的化工互作用力来分离混合物。这种互作用力通常是分析物及分析管柱之间的一种非共价性质。使用高效液相色谱时，液体待检测物在不同的时间被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，每个峰顶都代表一个另外化合物的种类，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。用途高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中，常用于医药品、化学、环保、生命科学、与食品工业的研究上。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成份分离、成分定性及定量分析。适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。1906年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromotography）和色谱图”（Chromatogram）的概念。他在论文中写到：“（原文）一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样，称之为色谱图。”1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。1952年，英国学者Martin和Synge 基于他们在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技术向前推进了一大步，这是气相色谱在此后的十多年间发展十分迅速的原因。1958年，基于Moore和S