中空纤维超滤膜浓缩水解胶原蛋白.doc

在单位体积膜组件中，中空纤维膜的有效膜面积最大，过滤分离效率高，容易清洗，结构简单，操作方便。中空纤维超滤膜浓缩水解胶原蛋白一、实验目的：掌握超滤膜分离的原理，了解超滤膜分离浓缩实验操作的主要工艺参数。二、超滤膜分离的基本原理： 超滤膜的材料主要有有机高分子材料和无机材料两大类。在本实验中使用的是纤维素酯类。该类物质的超滤膜亲水性好，成孔性好，材料来源方便、易得。但这种材料耐酸碱性差(适合pH46)，也不适用于酮类、酯类和有机溶剂。在一定的压力作用下，当含有高分子和低分子溶质的混合溶液流过超滤膜表面时，溶剂（如水）和低分子溶质将会透过超滤膜，作为超滤液被收集；高分子溶质则被超滤膜截留作为浓缩液被收集。需要指出的是，在上述情况下，是根据超滤膜孔径的大小来作为截留的依据。但在有些情况下，一些小于膜孔径的分子仍然会被截留。明胶是猪皮或牛皮中的水溶性胶原蛋白，其平均分子量在30KDa之间，不能通过截留分子量为6KDa的超滤膜。蛋白酶选择性水解明胶分子中的酰胺键，降低其分子量。经过蛋白酶的部分水解，明胶平均分子量降低至3-5KDa，能够通过上述超滤膜，因此，可用超滤膜进行分离。酰胺键在碱性条件下可与双缩脲试剂反应，产生蓝紫色，在520nm有最大吸收。在适当范围内，酰胺键的数量与蓝紫色呈正相关。此反应可用于快速测定蛋白质的含量。三、实验设备及溶液的配置：1.实验设备：(1) 中空纤维超滤膜组件型号：SL2型截流分子量：6000膜面积：0.5M2适宜流量：1050L/h组件结构如图所示。(2) 722s型可见分光光度计。2. 超滤料液的配制：量取蛋白质浓度为30%（m/mL）的水解明胶100mL，用纯净水稀释至3500mL-5000mL，搅拌均匀后用少量硅藻土助滤剂做滤层进行真空抽滤，收集滤液备用。 。四、实验步骤：1检漏：将储液槽内装满清水，打开1阀门，使磁力泵充满液体，通电启动，关闭各管路出口阀门，检查各接口是否漏液。2. 将储液槽用蒸馏水清洗干净（用pH试纸测流出液pH为7时即可）。清洗用蒸馏水从16阀门放出。3. 将料液放入储液槽中。4. 打开1#、3#、4、8、13、14、15阀门，接通电源，开启超滤膜分离装置进行分离。注意流量及压强的变化。5. 超滤15分钟后分别打开A和10阀门收集超滤滤过液、超滤截留液（另附页）。6.按双缩脲法测定其中的蛋白质浓度（另附页）；按照甲醛法测定其平均分子量。7. 722s型可见分光光度计简单操作法在520nm波长下用722s型可见分光光度计测定的吸光度。首先接好电源，将测定的波长置于520nm，打开暗箱，预热20分钟。将参比液（蒸馏水）放入光路，调节到透光率T100处，显示100.0，在吸光率A处，显示0.000。将待测液放入光路即可进行测量。8.系统清洗：打开4#、6和B2放掉残流在系统中的料液，接通清洗水系统，开泵运行首先用弱碱液进行清洗，洗至流出液无色后，用蒸馏水清洗至pH7。加保护液（1的甲醛水溶液）：停泵，放净系统中的清洗水，打开B2，从保护液槽加入保护液。五、思考题1. 解释为什么要测定超滤滤过液和截留液的平均分子量？2. 在实验结束时加保护液有何作用？3.甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？2、甲醛法测定其平均分子量 1）中性甲醛的配置 取分析纯甲醛10ml，用0.01mol/L NaOH溶液调pH 89（2）甲醛法测蛋白质分子量 取10ml待测液，用蒸馏水溶至50ml。 搅拌下用0.01mol/L NaOH调节pH 89。 加入10ml 中性甲醛溶液后，搅拌30min。 用0.01mol/L NaOH滴定，使pH 89，记录VNaOH平均分子量计算： M=M1.174S1000/（CV） M质量（固含量/10），S脱水后的固含量（蛋白质含量/100）， CNaOH浓度，VNaOH体积，甲醛法测定平均分子质量的原理：二、原理水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上的N+H3结合，形成NHCH2OH、N(CH2OH)2 等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H