三基因工程的基本条件-工具酶和细胞

Genetic Engineering,1.基因工程概述2.基因工程的基础知识与基本技术3.基因工程所需基本条件4.基因工程的操作过程5.目的基因的获取6.克隆基因的表达7.转基因生物技术,3 基因工程的基本条件,C 用于基因转移的受体菌或细胞,B 用于基因克隆的载体,A 用于核酸操作的工具酶,A 用于核酸操作的工具酶,3 基因工程的基本条件,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修饰酶,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链,主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵,细菌的限制与修饰作用,hsd R：编码限制性核酸内切酶,hsd M：编码限制性甲基化酶,hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出,Hind II和Hind III,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,（1）限制（Restriction）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）, Dam甲基化酶,GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基, Dcm甲基化酶,CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,I型限制性内切酶,如 EcoB和 EcoK。,未甲基化修饰的特异序列。,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。,（3）作用机理,在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,分离的第一个酶是Hind ,型限制性内切酶,限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶分子组成,分子质量小,能识别DNA的特殊序列,种类多,在基因工程中起重要作用.,III类限制性内切酶,在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,在基因工程操作中用途不大。,EcoP1: AGACC,EcoP15: CAGCAG,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR I的切割位点,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,连接便利,粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。, 补平成平齐末端,凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。, 5末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,识别位点的序列相同的限制性内切酶。,同裂酶（Isoschizomers), 完全同裂酶：,识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。, 不完全同裂酶：,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等,同尾酶(Isocaudamers）,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,？,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl ,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,Sau 3A,II 型限制性核酸内切酶的识别序列与DNA的切割,限制酶识别序列与DNA的来源无关,不具有种的特异性识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率识别序列的相邻序列效应限制酶的偏爱现象限制酶的星号活性,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位,引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、,Bgl II、Sau3A I不受影响,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列,中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,酶活性单位：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标 准DNA所需的酶活性定为1U,酶用量： 当DNA样品确定后，为完全切割此DNA，酶的用量视酶的催化活性而定。,容积活性：1ul酶溶液中具有的酶活性单位。根据完全切割1 g DNA所需酶量来换算。,限制性核酸内切酶,影响限制性核酸内切酶活性的因素,核酸内切酶的缓冲液性质：,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即,所谓的Star activity现象,EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘,油浓度超过50%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者,5AATT3,五种缓冲液：A B H M L，每种酶只有在最适的反应缓冲液中才具有最强的催化活性。,影响限制性核酸内切酶活性的因素,酶切消化反应的温度：,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0 - 150 mM,DTT,1 mM,0 - 50 mM 低盐酶,100 mM 中盐酶,150 mM 高盐酶,Volume,20 - 100 ml,T T,37 1 - 1.5 hr,MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；,限制性核酸内切酶,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,（1）必须是两条双链DNA。,（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+,连接条件,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,大肠杆菌DNA连接酶：只能催化双链DNA的互补黏性末端， 以NAD+为能量 T4噬菌体连接酶：黏性、平末端均可连接，以ATP为能量,1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。,连接反应的机理,2. ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。,3. AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。,OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+,+H3N,AMP,ATP,PPi,4. AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,5. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,连接多个平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,DNA连接酶,平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,DNA连接酶,DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50 - 100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5 mM,Volume,10 - 20 ml,T T,4 - 15 4 - 16 hr,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，,完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,1. 插入片段与载体的浓度比例,2. 反应温度,12.5。,五影响连接反应的因素,1020倍。,一般1416,DNA连接酶,3. 酶用量,基因工程中常用的DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶,DNA聚合酶,1. 共同特点,把dNTPs连续地加到引物的3OH端。,2. 主要区别,T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。,常用的DNA聚合酶的特点,持续合成能力和外切酶活性不同。,常用DNA聚合酶的特性比较,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dNTP Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）,切口前移标记法,大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Nick translation,制备32P标记的探针,DNase I,DNA pol I,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）,Klenow酶的基本性质：,大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端,三分之二的大肽段，即为Klenow酶,Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核,核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）,Klenow酶的基本用途：,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定DNA序列,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）,Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）,Klenow酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,3隐蔽末端的DNA片断,Klenow fragment补平,根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G3 3-CTTAA5,5-GAA3 3-CTTAA5,5-GAATT3 3-CTTAA5,5-G3 3-CCTAG5,5-GG3 3-CCTAG5,5-GGATC3 3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-32P-dATP,-32P-dGTP,25oC 1h,mRNA,cDNA第一链,逆转录,cDNA第二链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,Klenow酶的基本用途： cDNA第二链的合成,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性：,在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切,在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C- OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO -C-C-T-C 5,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+ 5 ppp dN 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OH,HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,T4-DNA pol,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,酶切中间产生两个末端标记,加入某种32P-dNTP和dNTPs,T4 DNA聚合酶 （35外切）,DNA酶切片断,T4 DNA聚合酶 （53聚合）,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,内切酶切,无dNTPs,（1）来源,从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：, T7基因5编码的大亚基：,有53聚合酶和35外切酶活性。, 大肠杆菌编码的小亚基：,硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性。,DNA聚合酶,T7-DNA聚合酶,T7 DNA聚合酶的特点, 持续合成能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。, 35外切酶活性高,单链和双链都能降解。, 不受DNA二级结构的影响,其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍, 进行末端标记, 以大分子量DNA为模板的合成,如M13, 补平隐蔽末端,T7 DNA聚合酶的用途,取代合成法标记3末端。,与T4 DNA聚合酶相同。,合成补平3隐蔽末端； 水解修平3突出末端。,修饰后的T7 DNA聚合酶,（1）T7DNA聚合酶的化学修饰,去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。,（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途, DNA测序,双脱氧法。, 标记DNA 3隐蔽末端, 更有效地补平末端,DNA聚合酶,依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,反转录酶,Mg2+ dNTP,5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,DNA聚合酶,依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,反转录酶,3 RNA,5 DNA,3,5,3 RNA,5 DNA,3,5,反转录酶,5 DNA,3,DNA聚合酶,TaqDNA聚合酶,基本特性： 53的DNA聚合酶活性 53的核酸外切酶活性 耐高温78-94度,用途： PCR扩增 DNA序列测定,核酸酶,单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,核酸酶,双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）,ExoVII,3,5,3,5,Mg2+,3,5,3,5,大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切,核酸酶,双链核酸外切酶：l 核酸外切酶（ lExo）,lExo,3,5,3,5,Mg2+,l核酸外切酶特异性地从5 端外切,3,5,3,5,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae）,Zn2+必需,最适pH范围为4.0 - 4.3,需要NaCl 10 - 300 mM,降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5 dNMPs 或 5 NMPs,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5,nick,gap,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,核酸酶,单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）,Ca2+,5 dNMPs 或 5 NMPs,ssDNA or RNA,Ca2+,Ca2+,核酸酶,单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变,EcoRI,A,B,C,EcoRI,EcoRI,B,C,A,Bal31,B,C,A,环化,A,C,核酸修饰酶,末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）,TdT的基本特性：来自小牛胸腺,催化DNA在其3-OH末端加NTP,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+ dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,TdT的基本特性：,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+ dATP,5 p,3 HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH 3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+ dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,AAAAAAAAAAA,核酸修饰酶,碱性磷酸单酯酶,来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）,来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）,5 p,OH 3,DNA or RNA,5 ppp dN,5 pppN,BAP / CIP,OH 3,5 HO,5 HO dN,5 HO N,核酸修饰酶,T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5-OH上加磷酸,5 HO,3 HO,OH 3,OH 5,T4-PNP,Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）,5