DNA提取纯化操作手册

1 DNA提取纯化操作手册 2006年11月，Version 1.0 目录 用前须知.2 质粒小提试剂盒3 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒.7 PCR产物纯化试剂盒.10 2 用前须知 一 试剂盒的保存： 试剂盒中不同试剂的保存方法，具体产品的说明书中均有详细的标示。大多数试剂保存于室温，即 25左右。在这样的温度条件下，试剂和吸附柱在保存效期内都是稳定的，并且许多试剂不会出现盐析和沉淀，方便使用。在冬季，室温可能会低于 25，这时许多试剂可能出现盐析，使用前需要37加热溶解至澄清后使用。在夏季，室温会高于25，这对吸附柱和试剂有较大的不利影响，建议将试剂盒置于4冰箱内贮存，使用前请注意试剂是否出现盐析现象。 二 离心时间和离心力的说明： 离心时间操作步骤的离心时间是指离心机达到指定速度后需要维持的时间，而不包括离心机达到指定速度所需要的时间。因此，您需要设定的离心时间就是离心机达到指定速度需要的时间加上操作步骤中指定的离心时间。记住：离心时间长一点关系不大，时间不足可能会导致实验失败。为方便使用，我们的操作步骤中已经考虑到离心机达到指定速度所需要的时间，因此您只需要按照操作步骤中的说明设定离心时间即可。 离心力离心机离心力的选择非常重要，离心力过高，导致吸附柱破裂，损坏您的离心机；离心力过低，实验可能失败。如非指出，我们均使用10,000g的离心力。如果您的离心机仅有转速（rpm）显示，请根据以下方法粗略换算： 离心力 转头种类 转速 10,000g 121.5ml 13,000 rpm 10,000g 181.5ml 12,000rpm 10,000g 241.5ml 11,000rpm 10,000g 301.5ml 10,000rpm 三 吸附柱的相关资料： 吸附柱的有效容积：是指吸附柱内的液体在经过离心后不滞留于吸附柱内的容积。我们生产的吸附柱有效容积为700l，如果上柱量超过此体积，请分次上柱。 柱吸附力：是指吸附柱在饱和状态下可以最大吸附的核酸量。如果没有进行预实验，请不要试图通过增加样品量的方法来提高提取的核酸量，因为吸附柱达到饱和后，再多的核酸也不能被吸附柱吸附，造成样品的浪费。下表是我们生产的不同吸附柱的柱吸附力： 吸附柱类型 适用试剂盒 柱吸附力 CP 质粒提取 20 g CA1 凝胶回收 10g CA2 产物纯化 10 g 得率：影响得率的最关键的因素有两个：片段大小和核酸含量。片段太小，就不能与吸附柱有效结合，得率降低，如100bp片段；片段太大，与吸附柱结合过于牢固，不易洗脱，得率也变低，如大于10kb的片段。吸附柱总是会吸附一些核酸不能被有效洗脱下来，当核酸含量过低时，被吸附柱滞留的核酸含量将大大上升，得率降低；而当核酸含量过高时，超过了吸附柱的最大吸附力，得率也会下降。因此，想要更进一步提高得率的话，可以选择以下方法： 1 将上柱后的洗脱液再次上柱，该方法适于核酸含量较低的样品。 2 延长洗脱时间，该方法适于较大的片段和核酸含量高的样品。 3 两次洗脱，该方法适于较大的片段和核酸含量高的样品。 3 质粒小提试剂盒（目录号：RTP2101） 试剂盒内容及保存： 试剂盒组成 RTP2101-01 （50次） RTP2101-02 （100次） 贮存方式 RNase A 150 l 300 l -20 Lysis Blue Dye 300l 600l 室温 溶液P1 15 ml 30 ml 室温 （加入RNase A 后2-8保存） 溶液P2 15 ml 30 ml 室温 溶液P3 20 ml 40 ml 室温 去蛋白液PD 30 ml 60 ml 室温 漂洗液PW 15 ml 215 ml 室温 洗脱缓冲液EB 15 ml 15 ml 室温 质粒吸附柱CP 50个 100个 室温 收集管（2 ml） 50个 100个 室温 说明书 1份 1份 储存条件和效期： 本试剂盒在室温（25左右）干燥条件下，可保存1年；更长时间的保存可置于28。 28保存条件下，若溶液产生沉淀，应在使用前置于37下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。 单独包装的RNase A 在-20可稳定保存1年以上。 加入RNase A后的溶液P1应置于28保存，可稳定保存半年。 产品简介及使用说明： 本试剂盒采用经典的碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合DNA的特性，可以从 15ml 大肠杆菌 LB 培养液中快速提取 320g纯净的高拷贝质粒 DNA。提取的质粒可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等实验。然而，对质粒纯度要求更高的转染实验（要求无内毒素），此试剂盒不能达到要求。另外，尽管该试剂盒可以抽提较大的质粒（10kb），但 我们不推荐使用。如果一定要使用，请参考以下方法：加大菌体使用量（使用 510 ml过夜培养物），同 时按照比例增加P1、P2、P3的用量；洗脱缓冲液应在70预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率，其它步骤相同。 产品特点： 1 使用了Lysis Blue Dye，菌体裂解是否完全一目了然。由于判断菌体裂解和中和是否彻底更主要取决于操作者的经验，所以我们增加了Lysis Blue Dye（一种能使裂解/中和体系变换颜色的试剂）来帮助观察裂解/中和的程度。加入P2后，Lysis Blue Dye立即使溶液变为蓝色，裂解是否完全只要观察蓝色背景下是否有白/黄色颗粒存在，如果蓝色非常均一，没有任何白/黄色颗粒存在，表明裂解充分。在完全裂解的体系中加入 P3 混匀后，体系立即变为无色，任何蓝色的残留表明没有完全混匀或者中和不彻底。 2 增加了去蛋白液PD，能更加彻底地去除蛋白污染，得到纯度更高的质粒。 准备工作： 1 将试剂盒附带的RNase A全部加入到溶液P1中（如15ml P1中加入150l RNase A）， 混匀后4贮存。 2 按照标签所示在漂洗液PW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。 4 3 每次使用前请检查溶液P2，溶液P3和去蛋白液PD是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37温浴至沉淀溶解后再使用。 标准操作步骤（不使用Lysis Blue Dye）： 如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1 取15 ml过夜培养的菌液加入离心管中，10,000 g离心1分钟，尽量吸除上清。 注： 关于转速的说明，请参见“用前须知”，下同。 菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。 2 向菌体沉淀的离心管中加入250 l溶液 P1（请先检查是否已加入 RNaseA）， 使用 移液 器或 涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 注：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 3 加入250 l溶液P2，温和地上下翻转68次使菌体充分裂解。 注：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；所用时间绝对不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。 4 加入350 l溶液P3，立即温和地上下翻转68次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。10,000g 离心10分钟。 注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 5 小心地将上清转移到吸附柱CP 中（吸附柱放入收集管中），10,000g 离心 3060秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。 6 向吸附柱CP中加入500 l去蛋白液PD，10,000g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。 7 向吸附柱CP中加入700 l漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇）， 10,000g 离心3060秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。 8 向吸附柱CP中加入500 l漂洗液PW，10,000g 离心3060秒，倒掉收集管中的废液。 9 将吸附柱CP置于收集管中，10,000g 离心2分钟。 注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，绝对不可省略，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验（酶切，PCR等）。 10 将吸附柱CP置于一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加50100 l洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，10,000g离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中，-20保存。 注： 为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入离心吸附柱中，再次离心收集。 洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。 使用Lysis Blue Dye的标准操作步骤： 如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1 取15 ml过夜培养的菌液加入离心管中，10,000g 离心1分钟，尽量吸除上清。 注：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。 2 向菌体沉淀的离心管中加入250 l溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）和5l Lysis Blue Dye，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 注：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 3 加入250 l溶液P2，温和地上下翻转68次使菌体充分裂解，此时溶液变为均一的蓝色。 注：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；所用时间绝对不应超过5分钟 ，以免质粒受到破坏；蓝色溶液 5 应该均一，看不见白/黄色颗粒。 4 加入350 l溶液P3，立即温和地上下翻转，充分混匀，混匀充分的标志是溶液完全呈白色絮状，如有可见蓝色，说明混匀不彻底。10,000g 离心10分钟。 注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果离心后上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 5 小心地将上清转移到吸附柱 CP 中（吸附柱放入收集管中），10,000g离心 3060秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。 6 向吸附柱CP中加入500 l去蛋白液PD，10,000g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。 7 向吸附柱CP中加入700 l漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇）， 10,000g 离心3060秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。 8 向吸附柱CP中加入500 l漂洗液PW，10,000g 离心3060秒，倒掉收集管中的废液。 9. 将吸附柱CP置于重新放回收集管中，10,000g 离心2分钟。 注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，绝对不可省略，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验（酶切，PCR等）。 10. 将吸附柱CP置于一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加50100 l洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，10,000g 离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中，-20保存。 注： 为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入离心吸附柱中，再次离心收集。 洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。 背景知识： 质粒提取原理：碱裂解法是目前应用最为广泛的提取质粒的方法，本试剂盒既是采取这种方法进行质粒的提取。其原理是：大肠杆菌细胞在碱作用下裂解（溶液P2处理），释放细胞内容物。当溶液回复到中性条件下（加入 P3后），细菌基因组、变性蛋白质以及细胞碎片结合在一起形成沉淀，而长度较短的质粒DNA留在上清中，离心去除沉淀后可以从上清中回收质粒 DNA。本试剂盒与经典的质粒提取方法（“分子克隆实验指南”中的方法）不同之处在于质粒纯化方式不同。经典的纯化方法使用酚/氯仿抽提去除蛋白污染，再用乙醇沉淀得到纯化的质粒DNA。本试剂盒使用硅胶膜为吸附材料，采用“高盐结合，低盐洗脱”的原理纯化质粒 DNA，即在高盐环境下质粒 DNA 吸附到硅胶膜上，然后用低盐缓冲液将质粒从硅胶膜中洗脱下来。与经典的纯化方法相比，操作方便快捷，得到质粒纯度更高。 影响质粒提取的因素： 质粒种类：低拷贝质粒如pBR322在提取时要用氯霉素处理对质粒进行选择性扩增，提取时使用的菌液要更多一些，一般用5-10ml；高拷贝质粒如 pUC系列，无需用氯霉素处理，使用 1-5ml菌液提取即可满足一般实验要求，如酶切，PCR等。 宿主菌种类：大肠杆菌endA菌株如HB101含有较高的核酸内切酶活性，如操作不当，容易降解质粒DNA，故质粒提取时尽量选取endA菌株如DH5，Top10等。 培养时间：单菌落接种到培养基中的培养时间一般在12-16小时，经验值OD6001.0-1.3。培养时间过长或过短都会降低质粒提取得率。 质粒DNA电泳检测： 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。理想情况下，质粒DNA在电泳检测时只有一条带即质粒的超螺旋构型。然而，碱裂解法提取的质粒在电泳时多数情况下你能看到三条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。 如果在溶液 P2 加入后过度 6 振荡或时间太长（超过 5 分钟）， 会有 第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，在加样孔附近，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。一般说来，电泳时只要超螺旋质粒占到质粒构型的60-80左右，并且没有基因组污染，这样的质粒足矣能够应付绝大多数下游实验了。 质粒DNA浓度计算 OD260值为1相当于大约50g/ml 双链DNA。取一定量的质粒 DNA提取物，用水稀释 n倍，用水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行质粒DNA浓度的计算： 终浓度（ng/l）=OD260n (稀释倍数)50 OD260/OD280比值是检测质粒纯度的标准之一。纯度较高的质粒此比值应在1.71.9之间，比值过低表明有蛋白污染，过高表明有RNA污染或质粒已经降解。另外，OD值受pH值影响较大，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液（pH8.5），而使用去离子水（pH一般低于7.0），比值会偏低，但并不表示得到的质粒纯度低。 质粒提取常见问题分析： 常见问题 可能原因 建议 质粒没有扩增 检查菌种新鲜纯度，重新培养 裂解不充分 起始菌体过量是导致质粒抽提失败的主要因素。记住：1ml菌液提取的质粒如能足够所需，不要使用2ml抽提质粒。 另外，使用Lysis Blue Dye观察菌体裂解是否彻底。 溶液P2，P3，PD使用不当 溶液P2，P3和PD低温时可能会出现浑浊，使用前请温浴振荡至澄清再使用。 PW使用不当 PW 使用前请按照标签加入无水乙醇。无水乙醇加入量不正确会导致质粒提取量大大降低。 洗脱液pH值不合适 确保使用的洗脱液 pH 在 8.0 以上，如低于8.0将导致质粒洗脱量过低。 抽提失败或质粒得率低 洗脱体积太小 洗脱体积不能低于 50l，如洗脱体积太小，回收率将大大降低。 蛋白污染 菌体过量，加入P3离心后上清如有悬浮颗粒，再次离心去除。 基因组DNA污染 加入P2后应温和混匀且时间不能太长，应该控制在5分钟之内。 RNA污染 RNase A消化不充分。加入RNase A的P1在4下如存放半年以上，要补加RNase A。 质粒纯度低 超螺旋比例低 加入P2后时间太长；混匀不够温和。 7 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：RTP2201） 试剂盒内容及保存： 试剂盒组成 RTP2201-01 （50次） RTP2201-02 （100次） 贮存方式 溶胶液PN 50 ml 100 ml 室温 3 M NaAc pH5.2 500l 500l 室温 漂洗液PW 15 ml 215 ml 室温 洗脱缓冲液EB 15 ml 15 ml 室温 吸附柱CA1 50个 100个 室温 收集管（2 ml） 50个 100个 室温 说明书 1份 1份 储存条件： 本试剂盒在室温（1525）干燥条件下，可保存 12 个月；更长时间的保存可置于 28。（注意：当低温贮存时，使用前应先将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间，必要时可在37水浴中预热10-20分钟，以平衡溶液温度。） 产品简介： 本试剂盒采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从TAE或TBE琼脂糖凝胶上回收DNA片段，同时去除蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。可回收100 bp40 kb大小的片段，回收率大于80%（10kb 的DNA片段回收率为3050 %）。 每 个吸附柱每次最多可吸附的DNA量约为10 g。 使用本试剂盒回收的 DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化等实验。 产品特点： 1 溶胶液PN为亮黄色，便于观察胶是否彻底融化和溶胶体系的pH是否合适。 2 操作快捷，单个样品操作少于15分钟。 注意事项： 1 电泳时最好换用新鲜的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果；如有可能，尽量使用TAE系统，因为有研究指出使用TBE系统后，回收产物中的痕量硼酸会影响后续的酶切反应。 2 切胶时，请尽量使用长波长的紫外光（360nm）；如果仅有短波长紫外光（254-312nm）的话，请尽可能缩短紫外照射时间，以免对DNA造成损伤；请尽量去除不含目的片段的琼脂糖凝胶，这将会对融胶很有帮助。 3 第一次使用前请按照标签说明在漂洗液PW中加入无水乙醇，并做好标记，用完后紧拧瓶盖。 操作步骤： 如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 2 向胶块中加入3倍体积溶胶液PN （如果凝胶重为100mg，其体积可视为100 l，则加入300 l溶胶 8 液）， 50-55水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。 注意： 如果此时溶胶液变为粉红色，请加入少量3M NaAc pH5.2（一般说来，10l足矣）， 使溶胶液变为黄色再上柱离心。 对于高浓度的凝胶（2）， 向 胶 块 中 加 入 6 倍 体 积 的 溶 胶 液 PN。如100mg凝胶加入600l溶胶液PN。 胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。 3 当目的片段500bp时，省略此步骤，直接进行步骤4。 4 将上一步所得溶液加入到吸附柱CA1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，10,000g离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。 注意： 吸附柱CA的有效容积为700l，如溶胶体系体积大于700l，分次上柱，保证全部溶液都加到吸附柱中。 10kb的片段请在室温放置5-10分钟，这将会提高回收效率。 5 向吸附柱中加入700l漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 10,000g离心30-60秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。 6 向吸附柱中加入500l漂洗液PW，10,000g离心30-60秒，倒掉废液。 7 将离心吸附柱CA1放回收集管中，10,000g离心2分钟，尽量除去漂洗液。 注意：此步必不可少！如果漂洗液有残留，将会影响回收效率和 DNA 质量，进而影响下游实验；离心后将吸附柱盖子打开，室温放置2分钟，这样将有助于彻底挥发残余乙醇。 8 将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 分钟。10,000g离心2分钟收集DNA溶液。 注意： 可将洗脱缓冲液EB预热到60-70后再加到吸附膜上，这样可以提高洗脱效率。 CA1柱的洗脱体积不应少于30 l，体积过小将会降低回收效率。 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率 9 DNA产物-20保存。 9 琼脂糖凝胶常见问题分析： 常见问题 可能原因 建议 漂洗液 PW 中未加入无水乙醇或加入的比例不正确 首次使用前请严格按照标签说明加入无水乙醇；用完后盖紧瓶盖，以防乙醇挥发。 凝胶没有完全溶解 按照凝胶重量与溶胶液 PN 的体积比为1：3加入溶胶液，并在融化过程中间歇混匀使凝胶完全融化 溶胶体系pH太高 如果溶胶体系变为粉红色，说明溶胶体系 pH 太高，DNA 不能与吸附柱有效结合，用少量 NaAc pH5.2将溶液颜色调至黄色 洗脱缓冲液pH不合适 吸附柱上的 DNA 在低盐和高 pH条件下被有效洗脱。其最大洗脱效率pH在7.0-8.5之间。如用灭菌水洗脱，保证pH在其范围内 片段未回收或回收率低 洗脱体积太小 洗脱体积不能低于 30l，并保证洗脱液加到吸附柱中间位置 切胶时紫外线照射时间过长，DNA变性 紫外线对DNA的破坏会导致连接后的转化效率大大降低。切胶时尽量使用长波紫外线（360nm）并提高切胶速度 回收产物中含有乙醇 漂洗液 PW 漂洗后，离心 2分钟必不可少；离心后开盖室温放置2分钟有助于残余乙醇挥发 回收后的片段无法进行后续实验如连接后的转化效率低 回收片段电泳有时出现双带或多带现象 PCR 产物更易出现如此情况，小片段尤甚。这种现象出现的原因不详，可能与片段GC含量和序列有关。如果出现这种现象，以下方案可以参考：将洗脱产物 95加热2分钟，移至室温自然冷却，即可恢复单带构型。另外一种方法：回收的此种片段-20贮存一周左右，大部分即可自然复性 10 PCR产物纯化试剂盒（目录号：RTP2202） 试剂盒内容及保存： 试剂盒组成 RTP2202-01 （50次） RTP2202-02 （100次） 贮存方式 结合液PB 50 ml 100 ml 室温 3 M NaAc pH5.2 500l 500l 室温 漂洗液PW 15 ml 215 ml 室温 洗脱缓冲液EB 15 ml 15 ml 室温 吸附柱CA2 50个 100个 室温 收集管（2 ml） 50个 100个 室温 说明书 1份 1份 储存条件： 本试剂盒在室温（1525）干燥条件下，可保存 12 个月；更长时间的保存可置于 28。（注意：当低温贮存时，使用前应先将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间，必要时可在37水浴中预热10-20分钟，以平衡溶液温度。） 产品简介： 本试剂盒采用离心吸附柱结合独特的缓冲液系统，从酶切、PCR等反应溶液中纯化DNA片段，同时除去蛋白质、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。使用本试剂盒可回收100bp10kb的DNA片段，回收率大于80%（10kb 的DNA片段回收率为3050 %）。 每 个吸附柱每次最多可吸附的DNA量约为10 g。 使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、测序、文库筛选、连接和转化等实验。 产品特点： 1 结合液PB为亮黄色，便于观察体系的pH是否合适。 2 操作快捷，单个样品操作少于10分钟。 操作步骤： 如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1 在PCR反应液中直接加入5倍体积的PB液，颠倒混匀后，全部加入到吸附柱CA2中，10,000g离心30-60秒，到掉收集管中的废液，将吸附柱CA2重新放入收集管中。 注： 如果PCR反应体系使用了石蜡油，无需去除，但要使用10倍体积的PB液。 如果反应体系小于50l，用水补至50l体系，再加入PB液。 如果体系体积大于700l，请分次上柱，保证全部溶液均加入到吸附柱中。 2 向吸附柱CA2 中加入 700l 漂洗液P