PCR引物设计基本思路

PCR 引物设计基本思路1. 根据实验需要，确定需要扩增的 DNA 序列，并知道其 CDS 区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）  ncbi 网站查询RBS             149.153/gene="eryF"CDS             158.1372/gene="eryF"1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgtatg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacggat gagcacctgg1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc1621 gccctgttcg ggcacagcat gggcgcgttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac     2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的 DNA 序列中无该酶切位点（generuner 分析） 。3.初步确定设计的引物长度。一般为 1530bp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。如果扩增产物500bp，引物长度为 1618bp 即可。若扩增产物为 45kb，引物最好不要少于24bp。引物 3末端应含有所研究基因特异序列中的 1730bp。4.5 正向引物的设计：4.1 酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的 5，3端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。A：扩增的 DNA 用于表达时：（1） 自身有启动子。如：LOCUS       VITVHBA                  689 bp    DNA     linear   BCT 26-APR-1993DEFINITION  Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.ACCESSION   M30794 M31721 X13516VERSION     M30794.1  GI:155319KEYWORDS    hemoglobin; promoter region.SOURCE      Vitreoscilla sp.ORGANISM  Vitreoscilla sp.Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales;Neisseriaceae; Vitreoscilla.REFERENCE   1  (bases 42 to 689)AUTHORS   Khosla,C. and Bailey,J.E.TITLE     The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotidesequence and genetic expression in Escherichia coliJOURNAL   Mol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)MEDLINE   89143453PUBMED   3067078REFERENCE   2  (bases 1 to 210)AUTHORS   Khosla,C. and Bailey,J.E.TITLE     Characterization of the oxygen-dependent promoter of theVitreoscilla hemoglobin gene in Escherichia coliJOURNAL   J. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)COMMENT     Original source text: Vitreoscilla sp. DNA.SWISS-PROT; P04252; BAHG$VITSP.FEATURES             Location/Qualifierssource          1.689/organism="Vitreoscilla sp."/mol_type="genomic DNA"/db_xref="taxon:60"misc_signal     33.40/note="promoter 2"-35_signal      55.61-10_signal      73.79misc_signal     86.92/note="promoter 1"RBS             130.133/note="putative ribosome binding site; putative"CDS             142.582/note="hemoglobin"/codon_start=1/transl_table=11/protein_id="AAA27585.1"                     /db_xref="GI:155320"/translation="MLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFDMGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNIENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHYPIVGQELLGAIKEVLGDAATDDILDAWGKAYGVIADVFIQVEADLYAQAVE"ORIGIN      1 aagcttacag gacgctgggg ttaaaagtat ttgagttttg atgtggatta agttttaaga61 ggcaataaag gtgctgctac accatactga tgtatggcaa aaccataata accatactga121 atgaacttaa ggaagaccct catgttagac cagcaaacca ttaacatcat caaagccact181 gttcctgtat tgaaggagca tggcgttacc attaccacga ctttttataa aaacttgttt241 gccaaacacc ctgaagtacg tcctttgttt gatatgggtc gccaagaatc tttggagcag301 cctaaggctt tggcgatgac ggtattggcg gcagcgcaaa acattgaaaa tttgccagct361 attttgcctg cggtcaaaaa aattgcagtc aaacattgtc aagcaggcgt ggcagcagcg421 cattatccga ttgtcggtca agaattgttg ggtgcgatta aagaagtatt gggcgatgcc481 gcaaccgatg acattttgga cgcgtggggc aaggcttatg gcgtgattgc agatgtgttt541 attcaagtgg aagcagattt gtacgctcaa gcggttgaat aaagtttcag gccgctttca601 ggacataaaa aacgcaccat aaggtggtct ttttacgtct gatatttaca cagcagtttg661 gctgttgcca aaacttggga caaatattg 扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。 可在所扩增的 DNA 序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切位点进行扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。（2）扩增片段里自身无启动子。因为在 5端增加的酶切位点（所选的酶切位点与启动子的酶切位点相同）中必须含起始密码子，如 NcoI（CCATGG） ，Nde I(CATATG),设计引物时，酶切位点的起始密码子要和 DNA 序列的起始密码子重叠.如上例：若添加的酶切位点为 NdeI，引物的 5端酶切位点应设计位 5CATATGTTAGAC3;若添加的酶切位点为 NcoI,因为其位点ATG 后的 G 与 DNA 起始密码子后的 T 不配对，在处理这个问题上有两种方法：一种是用 G 取代 T,其缺点是破坏了阅读框，可能对表达会有影响；另外一种方法是将酶切位点上的 G 改为 T,相应的酶切位点应改为 ACATGT,并查询是否有该酶存在,若有，可以直接利用，因为同尾酶也可连接。若无，可用平末端连接。B：若扩增的 DNA 用于阻断.如 eryF:1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgtatg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt      361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacggat gagcacctgg1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc1621 gccctgttcg ggcacagcat gggcgcgttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg因为只需要扩增出一定长度的与染色体 DNA 同源的序列就可以，所以对酶切位点的位置无特殊要求。只需要寻找与所需扩增的 DNA 配对较好的区域作为酶切位点就行。如上，可选择 ggatcc.42 克隆 PCR 产物的方法之一，是在 PCR 产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切克隆到用相同酶切的载体上。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制性酶对其识别位点进行有效切断。加的个数见 Biolabs242 所示，加的种类要和扩增的 DNA 序列相匹配。如 NdeI,Biolabs 显示在其酶切位点上加 4 个核苷酸时，酶切 2 小时，酶切效率达到50%，而加 1 个核苷酸时，酶切 20 小时酶切效率仍然为 0%，所以应在酶切位点前加 4个核苷酸；为了达到尽可能与需要的 DNA 配对，所以应选 gaac;4.3 在所添加的酶切位点后加 17-30 个与扩增的 DNA 配对的核苷酸序列。结合以上几点，对于 vhb 基因 5端引物可以为 5-gaac CATATG ttagac cagcaaacca ttaacatc3'。对于 eryF 基因可设计为 5-nnnggatcccgat cgtgtcggag gaag344 不同细胞对密码子的使用频率各不相同，密码子的使用频率与细胞内相应 tRNA的丰富是一致的，密码子使用频率高意味着需要较多的相应 tRNA，二者之间的相互协调有利于细胞内一些含量高的蛋白质的顺畅表达。同理，当人们期望人工合成的基因能在细胞内高效表达，也要选择该细胞偏好的密码子作为基因的密码子，这样可以充分利用细胞内丰富度高的 tRNA，使基因得到高效表达。所以对引物起始密码子以后的几个密码子要根据密码子的简并性进行改变。大肠杆菌基因密码子的使用情况：原核生物的代表大肠杆菌基因的研究开展最早，进展也最快。比较了大肠杆菌中 13 种含量较多的蛋白质的密码子使用情况发现这些高度表达的基因中密码子的使用有以下规律：对于以 C 或 U 结尾的同义密码子，如前两个碱基为A、U，则第三个碱基优先使用 C；前两个碱基为 C、G ，则第三个碱基优先使用U。这样的选择有利于在翻译时密码子与反密码子相互作用，两者的作用能不太强也不太弱，而一中度为宜即所谓最适相互作用能。5.  反向引物的设计(1) 表达时，要考虑终止密码子的位置，所扩增的片段里必须包括终止密码子 ，所以酶切位点应该在终止密码子后寻找。酶切位点的选择原理与 5端一样。(2)  扩增的 DNA 用于阻断。与表达时相同，只是无需过于要求酶切位点的位置。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                           6.应注意碱基分布的均衡性。引物应避免嘌呤或嘧啶的堆积现象，避免连续出现 4 个以上的同一碱基。7.检查两条引物是否存在二级结构或二聚体。 （dnaman分析）如上，VHB  ggatcccgat cgtgtcggag gaag；Two primers complementarity.Max complementarity in continuous: 4 bp, free energy=-1.60 Kcal/mol5'-CCCTGCAGCAGTCGCTGGGTGAG-3'|3'-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5'Max complementarity in discontinuous: 9 bp5'-CCCTGCAGCAGTCGCTGGGTGAG-3'|  |  |   |   |  | 3'-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5'8.计算 Tm 值。一般退火温度为 5560，而 Tm 值比退火温度高 515。两条引物的 Tm 值最好相同，相差不要超过 3。9.特异性分析。必须保证酶切位点后的特异性序列在已知的序列中不存在，否则会出现非特异性条带。（generuner 分析）EryF 引物正向:5-AAGGATCCAAGTCGCGCCGCCC-3反向:5-CAAGGATCCCATGCTGTGCCCGAA 3 PCR 反应量的选择:1. 要扩增的是总 DNA，在 PCR 反应前应预先变性总 DNA（即 100水浴中煮沸510min）2. 酶的选择对于扩增高 GC 的片段，应使用 LA Taq 酶，缓冲液也应该用 GC Buffer.3.  酶量的选择酶量过