药物的杂质检查

1,第三章 药物的杂质检查,1 药物的杂质与限量2 杂质的检查方法3 一般杂质的检查4 特殊杂质的检查与鉴定方法,熟悉,了解,掌握,药物中杂质的来源和分类 杂质限量的概念和计算 一般杂质和特殊杂质检查方法,药物中杂质鉴定方法,热分析法基本原理及在杂质研究中应用,本章学习要求,3,1 药物的杂质与限量,4,杂质,任何影响药品纯度的物质均称为杂质。 杂质无治疗作用影响药物的稳定性和疗效甚至对人体健康有害。,一.药物的杂质与纯度,5,药品纯度,药物的纯洁程度, 反映药品质量的一项重要指标。主要由药品质量标准中的“检查”项下的杂质 检查来控制。,6,注意,药物纯度的评价,药物的性状、理化常数、杂质检查、含量测定等作为一个有联系的整体来评价药物的纯度。,7,二、杂质的来源,杂质的来源,生产过程,储藏过程,合成过程中,原料不纯或反应不完全，中间体、副产物在精制中未除尽制剂过程试剂、溶剂、还原剂残留异构体、多晶体使用的金属器皿、装置、工具引入的金属杂质,8,毒性杂质:对人体有毒害的杂质,如重金属、砷盐信号杂质:一般无毒,含量多少反映药物的纯度,如氯化物、硫酸盐,一般杂质:多种药物生产或贮存过程中易引入杂质;含量高低与生产工艺水平有关。特殊杂质: 特定药物生产或贮存过程中引入的, 随药物不同而改变,无机杂质:源于生产过程,如反应试剂, 配位体, 催化剂, 重金属等有机杂质:未反应完全的原料, 中间体, 副产物, 分解物 残留溶剂:生产中使用有机溶剂,无机有机杂质和残留溶剂,三.杂质的分类,毒性,来源,一般和特殊杂质,化学类别和特性,有关物质,四、杂质的限量,定义,药物中所含杂质的最大允许量。,计算,百分之几或百万分之几（ppm）,表示,注意单位统一！,10,杂质限量控制,11,12,例1 茶苯海明中氯化物检查:取本品0.30g 置200ml量 瓶中, 加硝酸银试液25ml, 取续滤液25ml置50ml纳氏比色管中, 用水稀释成50ml, 与标准氯化钠溶液(10g Cl/ml)1.5ml制成的对照液比较, 求氯化物限量。,13,例2 肾上腺素上酮体的检查: 取本品0.2g,置100ml量瓶中, 在310nm处测定吸光度不得超过0.05, 酮体的百分吸收系数为435, 求酮体的限量。,14,例3 卡比马唑片(规格5 mg)中甲巯咪唑检查: 取本品20片, 置10 ml量瓶中, 加至刻度, 作为供试品;另取甲巯咪唑对照品, 制成100g/ml溶液, 分别取上述两溶液各10l, 展开,显色。供试液杂质斑点颜色与对照品比较不得更深。求杂质限量。,杂质研究规范p102,有机杂质在质量 标准中项目名称检查项目的确定限度的确定检查方法的选择,杂质检查方法,化学法(显色,沉 淀,产生气体, 滴定法)色谱法(TLC, HPLC, GC)光谱法(UV-vis, IR, AAS)热分析法),2 杂质的检查方法,16,肾上腺素中的“酮体”,利巴韦林中“有关物质”,“杂质吸光度”,一. 杂质研究规范,17,经研究和稳定性考察检出的, 并在批量生产中 出现的杂质和降解产物。,根据其生产工艺、起始原料情况确定检查项 目规定降解产物和毒性杂质的检查项目,其可能共存的其他对映体应作为杂质检查,消旋体药物,新药,原料药和制剂中的杂质,单一对映体药物,当已有其单一对映体药物法定质量标准时, 应在该消旋体药物质量标准中设旋光度检查项。,2.杂质检查项目的确定,针对性,18,3.杂质限度的确定,根据每日剂量来制订质控限度有机杂质的限度规定应包括：每一个已知杂质、未知 杂质及总杂质。仿制药品的杂质限度，应与已上市产品进行质量对比 研究。,药品安全生产可行批间波动药品稳定性,制订杂质限度应考虑的因素,19,4. 杂质检查方法的选择与验证,专属性:根据原料药或制剂的生产工艺及储存条件，以中间体、立体异构体、粗品、重结晶母液、经加速破坏性试验后的样品作为测试品进行系统适用性研究，考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的分离度是否符合要求。 采用HPLC法检查有机杂质时,常采用梯度洗脱检测限: 要符合质量标准中对杂质限度的要求, 最 低检测限不得大于该杂质的报告限度。,20,+,5-氯-水杨酸,2-氯-4-硝基苯胺,氯硝柳胺,二.杂质检查方法 1.化学法(显色反应）,21,杂质：5-氯-水杨酸,紫色配合物,灵敏度法检查,对照法检查,盐酸萘乙二胺,23,2.沉淀反应:盐酸肼屈嗪中游离肼检查,肼与芳醛产生腙沉淀,24,3. 生成气体:NH34. 滴定法:如硫酸亚铁中高铁盐检查,25,2.色谱法:有关物质检查首选方法,TLC法:许多国家药典用于药物杂质检查(p105-107)杂质对照供试品溶液自身稀释对照杂质对照品与供试品溶液自身稀释对照并用对照药物,26,已知杂质并能制备杂质对照品供试品溶液; 一定浓度杂质对照品溶液;分别点样于同一硅胶薄层板上， 展开、定位;比较、判断；确证色谱系统分离效能:杂质对照 液与供试液成混合对照溶液。,杂质对照品法,供试液(10 mg/mL), 氟喹啉酸(30g/mL), 混合对照液(1:1)各5L, 点样, 展开混合对照液: 环丙沙星与氟喹啉酸完全分离供试品中杂质斑点相应杂质对照斑点(0.3%),例 盐酸环丙沙星中氟喹啉酸检查,28,供试液自身稀释对照法,杂质结构不确定或无杂质对照品供试液按限量要求稀释至一定浓度 作为对照液供试液和对照液分别点样、展开、定位供试液所显杂质斑点对照液所显主斑点,29,如：吡罗昔康中有关物质的检查,供试液:20mg/mL对照液: 0.2mg/mL供试液与对照液点于同一薄层板;判断:供试品溶液杂质斑点颜色对 照液主斑点颜色,稀释 100倍,30,杂质对照品与供试品溶液自身稀释对照并用,杂质有对照品:杂质对照法检查；未知杂质或无对照杂质:供试液自身稀释对照法检查,31,供试品溶液: 20mg/ml 对照溶液: 0.10 mg/ml 对照品溶液:3-甲基黄酮-8-羧酸 0.10 mg/ml判断:供试品溶液杂质斑点2个与对照品溶液相同的位置上所显杂质斑点的颜色对照品溶液主斑点，另一杂质颜色对照溶液主斑点。,例 盐酸黄酮哌酯中有关物质的检查,稀释,32,无合适杂质对照品或供试品显示的杂质斑点颜色与主成分斑点颜色有差异与供试品相同药物作对照品。对照药物中所含待检杂质符合限量要求,对照药物法,供试液1: 5mg/ml; 供试液2: 0.2mg/ml; 对照品(药物): 5mg/ml点样10l; 展开、检视；供试液1与对照液主斑点相同; 供试液1杂质斑点颜色对照液对应杂质斑点颜色供试液2只显主斑点,例 马来酸麦角新碱中有关物质检查,34,该方法仅能定性或半定量薄层扫描法:定量分析,具有分离效能高、快速、简便等特点,精密度和准确度不如HPLC法高,作为HPLC补充,用于无紫外吸收或不能用HPLC法分析的组分检查,35,限量要求：规定杂质斑点数和单一 杂质量、杂质总量,36,HPLC法,外标法(杂质对照品法)加校正因子的主成分自身对照法不加校正因子的主成分自身对照法面积归一化法,(p108-110),37,外标法(杂质对照品法),38,例 卡托普利及其片剂中卡托普利二硫化物检查,供试品溶液: 0.5 mg/ml对照品溶液:卡托普利二硫化物对照品, 5 g/ml混合溶液:卡托普利和卡托普利二硫化物对照品 0.1mg/ml和15 g/ml适用性试验:混合溶液; R 4.0原料药: 二硫化物含量1.0%, 片剂: 二硫化物含量3.0%卡托普利标示量,39,加校正因子的主成分自身对照法,AS,CS:药物对照品峰面积和浓度；AR,CR:杂质对照品峰面积和浓度；,AS, CS:对照液(供试品稀释液) 药物峰面积和浓度；AX,CX:供试液中杂质峰面积和浓度,适用于已知杂质控制,杂质校正因子,消除杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差,40,例 红霉素A中红霉素B、C组分及有关物质检查,稀释,供试品溶液: 4mg/ml 对照溶液: (0.2mg/ml) 调灵敏度: 对照溶液, h主约为满量程的 20% 进样: 供试品溶液; 对照溶液 分析时间: 4t主 f红霉素A 1.0; f红霉素B 0.7; f红霉素C 1.0; f红霉素烯醇醚 0.09 判断： A红霉素B校正、 A红霉素C校正A红霉素A对照液 A红霉素烯醇醚校正0.6A红霉素A对照液; 其他AiA红霉素A对照液,41,不加校正因子的主成分自身对照法,AS, CS: 对照液(供试品稀释液) 药物峰面积和浓度；AX,CX: 供试液中杂质峰面积和 浓度；,适用于无杂质对照品,42,供试品溶液: 0.4mg/ml 对照溶液: (0.4 g/ml) 调灵敏度: 对照溶液, h主约为 满量程的 25% 进样: 供试品溶液; 对照溶液 分析时间: 2t主 判断: Ai 0.25A对(0.25%), Ai A对（1.0%）。,例 利巴韦林中有关物质的检查,稀释,43,面积归一化法,适用于供试品中结构相似, 相对含量较高且限度范围较宽的杂质含量粗略考查计算各杂质峰面积占总峰面积百分率,44,GC 常受到样品挥发性的限制;对于挥发性差或热不稳定的化合物, 虽然可以采取柱前衍生化试剂制备成衍生物或采用裂解、水解、硅烷化等方法预处理以增加其挥发性, 但毕竟增加了操作上的麻烦, 改变了原来样品的面目, 而且不易复原。GC 仅用于检查挥发性杂质和药物在生产过程中引入的有害有机溶剂残留量,45,GC法,挥发性杂质; 残留溶剂的检查同HPLC法标准溶液加入法: 精密加杂质对照液到供试液中, 测杂质含量, 扣除加入的对照液含量, 得供试液中杂质含量,46,CE:快速、高效、进样量小、分离模式多。目前受自身灵敏度和重复性的限制, 在药物杂质研究中的应用不普遍。超高效液相色谱法(UPLC , 粒径105 kPa) 能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度, 大大缩短分析时间, 适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。LC-MS 法对色谱峰进行峰纯度检查, 以验证分析方法的可靠性; 通过高分辨质谱提供的元素组成信息和LC-MS-MS法提供的碎片离子信息推断杂质结构LC-NMR:用于药物中杂质、药物代谢的产物以及手性药物的分析等,47,药物和杂质紫外特征吸收 差异；地蒽酚中二羟基蒽醌检查 二羟基蒽醌:max432nm； 地蒽酚:该波长下无吸收。,3.光谱法(UV),二羟基蒽醌的,规定：A4320.12； 杂质限量2.0%。,49,药物中无效或低效晶形的检查 晶形结构不同，键长、键角发生不同程度变化 某些特征峰的频率、峰形和强度差异。,IR,50,氯化物（硫酸盐、铁盐）检查 重金属检查 砷盐检查 干燥失重 炽灼残渣 残留溶剂,3 一般杂质检查方法,p118-129,51,1. 原理 （白色浑浊） 与一定量标准NaCl液同条件下产生的AgCl比较浑浊程度;标准氯化钠溶液浓度:10gCl/mL,一. 氯化物检查法,2.方法,样品管,对照管,53,3. 注意 平行试验反应最佳条件 硝酸酸性 氯化物范围: 50 mL供试液含Cl 5080g 观察比较 衬于黑色背景自上而下观察； 暗处放置5 min。,54,二、硫酸盐检查法,标准：100g SO42-/ml,红色,标准：10gFe/ml,三、铁盐检查法（硫氰酸铁法）,55,四、重金属检查法 (Pb),实验条件（溶液pH）下, 与硫代乙酰胺或硫化钠 作用呈色的金属。 检查重金属时以Pb为代表,56,1. 硫代乙酰胺法,条件 介质：醋酸盐缓冲液 (pH 3.5) 试剂：CH3CSNH2 杂质对照液：Pb(NO3)2 (10g/ml) 灵敏度范围： 1020 g/ 27ml,黄色至棕黑色混悬液,原理:,57,2. 炽灼后的硫代乙酰胺法,58,3. 硫化钠法,59,五.砷盐检查法（古蔡氏法）,原理：Zn与酸产生新生态氢，与药物中微量砷盐生成 挥发性AsH3，遇HgBr2试纸产生黄色至棕色砷斑,60,方法：古蔡氏法检砷器,8cm,有孔玻璃旋塞,导气管,AsH3发生瓶,溴化汞试纸,醋酸铅棉花(60mg),HCl Zn 粒碘化钾试液酸性氯化亚锡试液,生成砷斑,吸收硫化氢气体,61,讨论标准砷溶液: As2O3配制贮备液，临用前稀释成1gAs/mL酸性SnCl2: As5+As3+,62,KI作用： As 5+As 3+ ，KII2I,Zn2+不断被消耗使生成AsH3的反应向右进行。,63,PbAc2棉花作用：排除硫化物干扰。 样品或Zn粒中含硫化物时，酸性溶液中产生 H2S 气体能与HgBr2试纸作用产生色斑。 H2S与PbAc2反应生成PbS沉淀留在棉花上,64,二乙基二硫代氨基甲酸银法Ag(DDC)法,红色胶态银,目视比色法,510nm 测定A值,65,线性范围：110g/40ml含锑药物不干扰测定用于砷盐的限量检查和微量 砷盐的含量测定,66,干燥失重: 规定条件下，药品经干燥减失量(%) 检查药物中水分及其他挥发性物质。 恒重:供试品连续两次干燥或炽灼后称重差异 0.3 mg,六、干燥失重法,67,测定方法,68,有机药物经炭化或挥发性无机药物加热分解后，高温炽灼所产生的非挥发性无机杂质的硫酸盐。,0.1%0.2%,七、炽灼残渣,69,残留溶剂：在合成原料药，辅料或制剂生产的过程中使用的，但在工艺中未能完全除去的有机溶剂。 填充柱检查方法：GC法 毛细管柱检测器：FID ECD ：含卤素残留溶剂,八、残留溶剂法,70,药品中常用残留溶剂,71,用待测物色谱峰计算，填充柱n1000；毛细管柱 n5000 待测物与邻峰R1.5； 内标法：对照液进样5次，所得待测物与内标物峰 面积之比的RSD5%； 外标法：所得待测物峰面积的RSD10%,系统适用性试验,72,测定方法,顶空进样： 样品溶液于密闭容器中， 一定温度下加热一段时 间， 气液达平衡， 取气相部分进行GC， 测定样品上方蒸气中组分 在原样品中含量 免去样品萃取、浓集等， 避免供试品中非挥发组分对 色谱柱的污染,74,顶空平衡时间3060min; 平衡温度低于溶解供试品所用溶剂沸点10以下水溶性药物：水为溶剂； 非水溶性药物：二甲亚砜(DMSO), N,N-二甲基甲酰胺(DMF)对照液和供试液的基质差异用标准加入法消除,75,76,特殊杂质研究规范特殊杂质鉴定合成杂质对照品法色谱制备杂质对照品法,4 特殊杂质检查与鉴定方法,77,超过鉴定限度的杂质:确定来源,推测可能结构, 判断该杂质对药物安全性的影响;稳定性研究中产生的超过鉴定限度的降解产物也应做相应的结构鉴定。有关物质的定性研究:获得有关物质结构信息; 其形成过程的分析:设法避免该杂质产生,或经纯化使之含量降至最低。,化学药物杂质研究的技术指导原则2005年,78,药物中有关物质结构研究的步骤,采用不同分离机制的色谱分离方法检测有关物质, 结合合成、制备路线与MS的检测推测有关物质的可能结构, 然后取可能存在的杂质(如合成过程中的原料、中间体等)与含杂质的药物进样, 在相同的色谱条件下考查已知化合物与该杂质的保留时间是否一致; 也可将已知化合物加入含杂质的药物中, 考查拟确定的杂质峰面积是否有变化。利用DAD, 观察拟定性的有关物质的紫外吸收, 或与已知化合物的紫外吸收光谱进行对比, 分析该杂质结构中可能存在的官能团。,79,采用GC-MS 或LC-MS-MS联用技术, 为有关物质的结构确定提供相关信息; 或利用LC-IR和LC-NMR等联用技术, 在不分离杂质的情况下在线获得杂质的IR 和NMR 图谱; 或利用制备型色谱获得有关物质的样品, 然后通过IR、MS、NMR 的检测, 确定有关物质的结构。合成已知结构的有关物质, 并与药物杂质的色谱数据和光谱信息进行对照, 以确定有关物质, 并建立其定量测定方法。,80,特殊杂质研究规范,定性或结构确证表观含量0.1%杂质0.1%强烈生物作用杂质或毒性杂质,81,特殊杂质鉴定,合成杂质对照品法杂质量较小，分离纯化困难比较色谱性质、UV特征和MS盐酸非索非那定中杂质鉴定:长期留样杂质2增加1.53%, 采用LC-MS鉴定,82,83,84,中间体水解得杂质2，HPLC测定合成的杂质2，与留样