八年制综合实验

HBV DNA定量检测,上海交通大学医学院刘湘帆 讲师,PCR基因的原理,一、PCR技术的发展及原理 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。,PCR原理,PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性退火引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。,PCR的基本原理,PCR基因扩增仪的工作原理,PCR基因扩增仪的工作原理PCR基因扩增仪工作关键是温度控制,技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。,荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）,荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量,荧光定量PCR是融合了PCR高灵敏性、DNA杂交高特异性和光谱分析的精确性，直接检测扩增过程中双链DNA荧光信号的变化以获得定量的结果。系统内装置有半导体PCR、卤钨灯光源激发荧光信号、光栅分光、超低温光电耦合器（CCD）摄象机收集荧光信号、计算机软件分析系统等。,荧光定量PCR检测的是样本的初始浓度，而准确测定初始浓度需要在对数期进行。,The software displays the fluorescence signals in real-time immediately after each measurement. Signals from the samples are obtained as the machine positions the capillaries sequentially over the optical unit. During thermal cycling, fluorescence can be measured once per cycle for every capillary and the fluorescence values are displayed immediately on the screen and updated after every cycle (Fig.3). The generated data are stored for further analysis.,荧光定量PCR在每一次循环后对进行实时监控，因此能最准确反映出对数期。确定准确的初始浓度。,软件系统可以进行参数设定、保存数据和报告结果，并将结果自动保存在计算机中。,相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。,荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。,Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，所以具有良好的重现性。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,荧光信号的检测方法：1、DNA结合染料技术2、水解探针技术（TaqMan probe）技术3、杂交探针技术4、分子信标,The biggest disadvantage of SYBR is that it binds to any dsDNA; the specific product, non-specific products and primer dimers are detected equally well. The LightCycler Instrument allows melting curve analysis Once the melting point of the product has been determined the LightCycler Instruments flexible programming allows the user to acquire fluorescence above the melting temperature of the primer dimers, but below the melting temperature of the product.,缺点：存在非特异性产物，可以与非特异性产物，甚至引物二聚体结合发出荧光。,可以使用熔点曲线分析进行鉴别，明显提高诊断的特异性。（F1通道）,2、TaqMan水解探针技术,杂交探针技术对PCR产物定量又称荧光共振能量转移，FRET需要一对引物和一对探针，探针A的3端为荧光染料供体；探针B的5端作为荧光染料受体。2个探针首尾相连，仅差一个碱基。检测在退火时进行。,Advantages of the LightCycler SystemWatch amplification as it occurs: real-time, on-line fluorescence allows you to see the results of every cycle as soon as PCR proceeds Save time: extremely rapid PCR, 20 minutes for 30 cycles Verify amplicon specificity: melting curve analysis provides differentiation between amplification products Detect mutations: changes in the melting curve analysis can be used to identify mutations Minimize contamination: amplification and detection are performed in the same closed tube,荧光定量PCR技术的优点1）定量准确，实时监控2） 敏感性和特异性高3）简单快速，30个循环20几分钟就能够完成。4）污染可能性小5）不需要常规的产物后期复杂处理，直接观测结果6）可以进行点突变分析，根据熔点曲线的不同直接分析点突变的情况。,Figure 3. Mutation detection by melting curve analysis. Top panel: melting curves of amplified gene fragments from wild-type and mutant individuals. Bottom panel: negative first derivatives of the melting curves showing the unique melting peak of each genotype. The gene fragment amplified from the heterozygous individual exhibits a melting curve with both the wild-type and mutant peaks (red plot).,HBV的定量检测,标本：病人血清200l检测：HB