基本实验技术

基本实验技术,实验目的,掌握：常用实验动物的捉取、固定与给药方法；实验动物的麻醉方法、气管插管方法、动静脉插管方法、尿管插管方法、输尿管插管方法。熟悉：颈部和腹部手术操作的基本技术，常用仪器设备与手术器械的使用方法，实验动物取血法和处死的方法。了解：常用实验动物的主要生物学特性及应用。,实验动物：家兔。实验器材：兔手术台、手术器械、玻璃分针、气管插管、动脉夹、塑料动脉插管、三通管、注射器（1ml、5ml）、压力换能器、BL-420生物机能实验系统。药品与试剂：1.5戊巴比妥钠、肝素生理盐水(500Uml)。,药品,戊巴比妥钠（1.5%） 为中效巴比妥类药物。戊巴比妥钠是最常应用的麻醉剂，需保存在阴凉处。一般作用时间可维持24 h。使用剂量为30mg/kg，使用方法为静脉注射（iv.）或腹腔注射（ip.）。生理盐水肝素（1:10000） 肝素是一种酸性黏多糖，主要是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生。肺心肝肌肉等组织中含量丰富，生理情况下血浆中含量甚微。无论在体内还是体外，肝素的抗凝作用都很强，故临床把它作为抗凝剂广泛使用。 肝素在动物体内抗凝的剂量一般为310mg/kg，体外血液抗凝浓度为0.10.2mg/ml。,常用手术器械,哺乳动物手术器材清单,家兔的抓取,用右手抓住家兔颈背部皮肤，轻轻把动物提起，迅速以左手托住其臀部，使家兔的体重落在左掌心上。 家兔一般不咬人，但脚爪锋利，捉取时需注意。【操作要点】 不得提抓家兔腰部、单手提兔背或提兔耳，否则会分别伤两肾、造成皮下出血及伤两耳。,麻醉药物应用原则：依据动物体重计算麻醉药物的剂量；依据动物生命体征变化控制给药速度；掌握宁少勿多、分阶段给药的方式。,针对不同的动物，选择不同的麻醉药物、实施不同的麻醉方法。,家兔称重,家兔全身麻醉,麻醉剂：1.5%戊巴比妥钠，2ml/kg,根据实验动物的不同，可以配置1%- 3%水溶液，一次给药麻醉维持时间3-4小时，一次补充量不宜超过原给药量的五分之一。,家兔全身麻醉,给药方法：耳缘静脉注射,家兔全身麻醉,拔去兔耳外侧缘被毛，用手指弹动或者轻轻揉搓兔耳，使静脉扩张，充盈。术者左手的食指和中指轻夹耳缘静脉的近心端，使其进一步充盈扩张，拇指和无名指固定耳廓的末端，并使其被拉直。右手持注射器（针尖斜面向上）由远心端刺入静脉。再顺着血管腔向心脏端刺进约1cm，回抽针栓，如有血表示刺入静脉，然后由左手的拇指，食指，中指将穿刺的静脉段与针头紧紧捏住以固定两者之间的关系，右手推药物入血。,家兔全身麻醉,如果感觉推注的阻力很大，并且局部肿胀，表示针头已经滑出血管，应该重新穿刺。耳缘静脉穿刺，应该尽可能的从远心端穿刺。,注意：,麻醉具体操作：,家兔全身麻醉,前2/3快速推入，使动物能顺利、快速地渡过兴奋期；后1/3速度宜慢，且边注射边注意观察动物的生命体征变化，当确定已达到麻醉效果时，即停止给药，不必急于将剩余的麻醉药物全部推入。,理想的麻醉状态：,家兔全身麻醉,动物失去知觉，呼吸变慢平稳，角膜反射消失或者极迟钝，全身肌肉松弛，对夹捏肢体末端的挣扎反应消失或者迟钝。,麻醉成功标志,角膜反射迟钝,肢体肌肉松弛,疼痛反射消失,家兔的固定与备皮,固定：成功麻醉以后，将家兔固定，将兔仰卧位 置于兔手术台上，四肢展开用粗棉绳固定。布带一端扎在前肢腕关节和后肢踝关节以上部位，两前肢布带在兔背后交叉穿过，分别压住对侧前肢后固定在解剖台两侧。两后肢左右分开，分别固定在实验台尾端。固定头时，也可用一粗棉绳钩住兔门齿，固定在兔台头端铁柱上。 备皮：剪刀贴住皮肤剪毛；提起毛再剪，易剪破皮 肤,仰卧位固定在手术台上，使颈部放正拉直。,气管插管术,气管插管是指将一个金属、玻璃的Y形导管插入动物的气管，普遍应用于哺乳动物急性实验中。,气管插管的意义在于保持麻醉动物呼吸道通畅，便于清除气道内分泌物。,1、麻醉固定、颈部皮肤去毛、备皮,2、在颈前区（喉的下缘和胸骨上缘之间），沿正中线作一约5-7cm的切口,3、钝性分离皮下组织、肌肉，游离出气管，穿线备用。,用止血钳反复撑开组织的方法，沿正中线纵向分离皮下组织，暴露颈前肌肉群，再沿着正中线顺肌肉走形方向钝性分离肌肉，暴露气管。,3、钝性分离皮下组织、肌肉，游离出气管，穿线备用。,沿气管走形方向分离气管两侧及其与食道之间的结缔组织，游离气管，在气管的下方穿一根棉线。,游离一段气管、穿线、剪倒T口 气管插管,软骨,心脏,头,4、在甲状软骨下方第3-4个环状软骨上作一倒“T”形切口，插入“Y”形气管插管。 检查通气是否良好 （方法：将少许兔毛放在插管口，观察兔毛是否被吹动） 并用线将气管与气管插管一起结扎，并固定，以防止气管插管滑脱。,颈总动脉插管,颈动脉插管是指将一根充满肝素或者其它抗凝剂溶液的导管插入颈总动脉，可用于检测多种生理、病理、药物因素作用时动脉血压的变化，也可以用于采集动脉血样。,1、由颈正中剪开一约5-7cm的口2、钝性分离皮下筋膜,3、分离一侧颈总动脉，穿双线备用。,术者左手拇指，食指捏起颈部皮肤切口缘和部分颈前肌肉稍向外牵拉其余三指将背侧皮肤向腹侧轻轻顶起，即可清晰的显露颈总动脉，右手持玻璃分针顺颈总动脉走行方向轻轻划开其周围的结缔组织，游离颈总动脉3cm，并在其下方穿2根丝线备用。（同时准备充满肝素生理盐水的动脉导管，排尽导管内气泡。）,动脉插管,心脏,头,4、结扎远心端，在距结扎线约2-3cm处用动脉夹夹闭颈总动脉近心端。,5、在靠近结扎线处用眼科剪剪一“v”形切口，切口大小约为动脉口径的1/3-1/2。,术者左手小指自下方托起血管，右手持眼科剪在靠近结扎线处成45o角剪开颈总动脉，剪口的大小约为动脉直径的1/3-1/2，将动脉导管向心脏端插入颈总动脉1cm，用丝线结扎动脉与动脉导管，固定导管，防止滑脱。放开动脉夹，既可以检测动脉血压。,动脉插管,6、将压力换能器与动脉插管连接好并充满肝素，向近心端插入动脉插管，用线结扎牢固。,三通管的使用：,进入BL410/420系统。,或选择“输入信号”选择“通道”“压力”点击“开始”实验按钮，即可在屏幕上观察到正常的血压曲线。,选择“实验项目” 选择“循环实验” “兔动脉血压调节”实验模块。（默认1通道）,7、打开换能器开关，观察并记录动脉血压。,一级波（心搏波）：由心室舒缩引起的血压波动，心缩时上升，心舒时下降，频率与心率一致。 二级波（呼吸波）：由呼吸运动引起的血压波动，其频率与呼吸频率一致。,动脉插管注意事项,动脉插管和血压换能器内注满肝素生理盐水以排气抗凝。压力换能器与动物心脏等高。动脉插管与颈总动脉呈一条直线，方向一致 。掌握好三通管的方向。结扎固定牢固。,动物实验常用插管技术,气管插管术 颈动脉插管术 颈静脉插管术 输尿管插管术,插管技术的基本步骤,1. 动物称重、麻醉、固定。2. 插管部位皮肤去毛、备皮。3. 皮肤切开。4. 皮下组织结构的分离。5. 目标器官或组织结构的游离。6. 导管的插入或固定。,实验动物的捉拿和固定方法1. 小鼠,捉拿时先用右手将鼠尾抓住提起，放在较粗糙的台面或鼠笼上， 在其向前爬行时，右手向后拉尾，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和头颈部皮肤，将其固定于左手手心中，拉直四肢并用左手无名指压紧尾和后肢，右手即可作注射或其他实验操作。取尾血及尾静脉注射时，可将小鼠固定在金属或木制的固定器上。,小鼠、大鼠灌胃法,器械：灌胃器 由注射器和特殊的灌胃针构成。小鼠灌胃针长45cm 直径1 mm大鼠灌胃针长68cm 直径1.2mm,小鼠灌胃法,按正确方法用左手抓取和固定动物。使腹部朝上，颈部拉直固定后，右手持持接灌胃针的注射器吸取药液（或事先将药液吸好），将针头从口角插入口腔内，然后用灌胃针头压其头部，使口腔与食管成一直线，再将灌胃针头沿上腭壁轻轻进入，转动针头刺激动物吞咽，然后沿咽后壁慢慢插入食道。若动物挣扎厉害，应退出后