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西南大学植物保护学院昆虫学及害虫控制工程重点实验室 博士生 袁明龙指导教师 王进军教授 柑橘全爪螨微卫星位点的发掘及种群遗传结构研究 植保硕博论坛 科学问题的提出 柑橘全爪螨重要的经济意义 柑橘是世界第一大水果目前 中国柑橘种植面积和产量均为世界第一 科学问题的提出 柑橘全爪螨重要的经济意义 在影响柑橘生产的诸多因素中 害虫害螨的为害是最为重要的因素之一柑橘全爪螨在我国及世界各柑橘产区为害最为严重发生特点为害周期长 14 24代 年 难防治 抗药性 发生范围广 各柑橘产区 科学问题的提出 柑橘全爪螨重要的经济意义 发生范围广 为害时间长 种群密度高 防治难度大 科学问题的提出 柑橘全爪螨控制面临的困境 体小 世代多 繁殖力强 用药次数多而不合理 农业防治Agriculturalcontrol生物防治Biologicalcontrol化学防治Chemicalcontrol生态控制Ecologicalcontrol 持续控制Sustainablecontrol和注重生物的IPMBiointensiveIPMStenseth 1987 指出 解决害虫问题的合理答案必须以害虫遗传学和进化策略的研究为基础 这些方面的研究与害虫的生物学和生态学的研究一样重要 科学问题的提出 柑橘全爪螨控制面临的困境 科学问题的提出 柑橘全爪螨如此微小的个体 为何对柑橘产业造成如此巨大的损失和威胁 柑橘全爪螨对众多杀螨剂快速地产生高水平抗性 其种群遗传有何特点 在产雄孤雌生殖的生殖模式下 柑橘全爪螨具有高的遗传多样性吗 若不是 何以高适应性 在我国 柑橘全爪螨不同地理种群是否存在显著的种群遗传结构 种群间的基因交流强度如何 地理隔离是其种群遗传分化的主要因素吗 我国的柑橘全爪螨种群可划分为几大分支 发掘多态性微卫星位点 柑橘全爪螨不同地理种群遗传结构及其分化机制 柑橘全爪螨种群遗传 进化及分化机制 线粒体DNA CO 12S cob etc 柑橘全爪螨可持续控制提供遗传学信息 科学问题的提出 核糖体DNA ITS1andITS2 柑橘全爪螨全线粒体基因组序列测定与分析 第一部分柑橘全爪螨微卫星位点的发掘 微卫星富集文库构建策略 磁珠富集法高效EfficientTraditionalMethods安全SafeRadioactiveHybridizaton磁珠富集法是目前国际上应用最为广泛的微卫星位点发掘策略 第一部分柑橘全爪螨微卫星位点的发掘 磁珠富集法构建微卫星富集文库技术路线 第一部分柑橘全爪螨微卫星位点的发掘 Fig 1GenomicDNA 23kb 1000bp 500bp Fig 2PCRproductsafterenzyme digestedDNAfragmentsareligatedwithadaptor HighmolecularweightDNAwassuccessfullyextractedfrommites Thesefragmentsareabout500bp indicatingthatenzymedigestionandadaptorligationaresuccessful 第一部分柑橘全爪螨微卫星位点的发掘 RecoveryPCRproductsofenrichedmicrosatelliteDNA PCRproductsarecontinuoussmearfrom400bp 1000bp indicatingthatenrichmentsbymagneticbeadsaresuccessful 第一部分柑橘全爪螨微卫星位点的发掘 构建的微卫星富集文库AC 富集文库 TC 富集文库 ATG 富集文库 ATC 富集文库富集文库微卫星位点发掘每个文库挑选192个克隆进行菌液PCR 对含有两条带及以上的克隆进行测序微卫星阳性克隆率均在30 左右除了冗余序列及侧翼序列短而不能设计引物的序列外 设计了30多对微卫星引物10多对引物已经建立了稳定的PCR扩增体系 可用于种群遗传结构研究 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 Thetypicalarthropodmitochondrialgenomeiscircular ranginginsizefromapproximately15to17kbandencodinggenesof13proteins COI III CytB ATP6and8 ND1 6and4L 22transferRNAs tRNA tworibosomalRNAs srRNAandlrRNA andaD loopcontrolsequenceforinitiatingreplication HighratesofnucleotidesubstitutioncomparedwithnuclearDNAMaternalinheritancethatisnotsubjecttorecombination 线粒体是应用最为广泛的分子遗传标记 蜱螨学研究中亦较多 采用COI对我国二斑叶螨和朱砂叶螨均进行了研究 而柑橘全爪螨国内外均无 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 柑橘全爪螨不同地理种群采集 15个种群 每个种群收集100头以上雌成螨 DNA提取及mtCOI基因PCR扩增采用Chelex法 总共提取300头柑橘全爪螨 每个种群提取20头 最终121头成功进行了PCR扩增及测序数据分析ClustalX比对 并提交到GenBank GU002449 GU002470 遗传多样性分析 MEGA4 1 DnaSP5 10 00 系统进化分析 jModelTest0 1 1 Mrbayes3 1 2 进化网络图分析 TCS1 21 种群遗传结构分析 Arlequin3 1 SAMOVA1 0 中性检测及mismatchdistribution DnaSP5 10 00 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 柑橘全爪螨遗传多样性指标 n为测序的个体数 h和 分别为单倍型和核苷酸多样性 柑橘全爪螨AT含量丰富 74 7 15个种群121个体总共22个单倍型JX种群单倍型最多 而BB JJ BL和FJ仅有频率最高的H7单倍型NJ单倍型多样性最高 YX核苷酸多样性最高 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 种群遗传变异 PairwiseFSTvaluesamongpopulationsforP citripopulationsbasedonCOIsequences PairwiseFST表明 RL YX和DJK与大多种群存在显著的遗传分化 而部分种群的FST为负值 表明存在一定的基因流 种群遗传分化分析 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 种群遗传结构分析 AMOVA分析表明 柑橘全爪螨4个group存在显著的遗传结构 CT 0 383 P 0 005 ST 0 503 P 0 001 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 Z 217 7436 r 0 2390 P 0 0330 Manteltest显示 遗传距离与地理距离显著相关 表明地理隔离是柑橘全爪螨种群遗传分化的重要因素之一 柑橘全爪螨22个单倍型的贝叶斯系统发育树 系统发育分析22个单倍型可分为两个支系来自日本的柑橘全爪螨及P osmanthi包含在支系 中 P osmanthi P citri P mori 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 柑橘全爪螨22个单倍型的进化网络图 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 ResultsoftheneutralitytestscalculatedforthefourgroupsofP citribasedonCOIsequences P 0 01 中性进化检测结果 总体上 柑橘全爪螨具有较低的遗传多样性15个种群可分为4个显著不同的group 且呈现出显著的遗传结构 暗示4个group可独立防治15个种群中 大多数种群之间分化显著 但部分种群之间存在基因流 暗示这些种群宜协同防治系统树表明 22个单倍型构成两个支系 中国的柑橘全爪螨可能不是单一种 而是复合种Populationgeneticstructureofthecitrusredmite Panonychuscitri Acari Tetranychidae strongsubdivisionbasedonmitochondrialCOIgenesequences submittedtoJEE 基于COI数据柑橘全爪螨种群遗传结构研究总结 第二部分基于COI数据分析种群遗传结构 第三部分讨论与展望 柑橘全爪螨低的遗传多样性是如何适应逆境 杀螨剂等 进一步探讨其遗传多样性 mt12S 已完成 ITS1 正在进行 cob和微卫星 即将开展 柑橘全爪螨种群遗传结构及分化机制地理隔离 微卫星 异域物种形成机制 寄主的局部适应机制 微卫星 同域物种形成机制 药剂对种群的遗传分化作用 微卫星 正选择 柑橘全爪螨是单一种还是复合种 全线粒体基因组测序与分析 6k