酶联免疫吸附测定123

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）,,Company Logo,抗原-抗体反应的特点与影响因素,反应条件：自身因素: 环境因素: 适宜温度 电解质 酸碱度,特点： 特异性 可逆性 最适比例,,Company Logo,凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。,沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。,补体参与的反应,免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。,抗原-抗体反应的基本检测方法,,Company Logo,用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。,用FITC-抗IgM单抗计数B细胞,免疫荧光技术,,Company Logo,课程内容,ELISA的原理ELISA的分类间接ELISA的具体操作ELISA在医学中的应用实例,,Company Logo,ELISA的原理,1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原或抗体的固相化 3.抗原或抗体的酶标记,E,,Company Logo,间接ELISA,实验目的：小鼠IgG免疫兔，检测兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料：包被抗原：小鼠血清 待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.05%吐温20） 显色液：四甲替联苯胺(TMB) 终止液/终：2M硫酸,阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。,,Company Logo,操作步骤,包被：1：2000稀释的正常小鼠血清，4过夜,封闭：5%脱脂奶粉，37 ，20min,加待检抗体：倍比稀释兔抗鼠IgG抗血清，37 15min,加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清(已稀释好) ， 37 15min,加底物液显色,洗涤：3次，1min/次,洗涤：3次，1min/次,洗涤：3次，1min/次,终止液终止显色（黄）,空白对照无显色,待测样品显色明显(蓝),E,E,E,E,底物液,底物、终止液加50ul孔,封,一抗,二抗,无色避光,从此步开始本次实验！,,Company Logo,倍比稀释法与加样,除第一列孔外，先在其余每孔加100ul稀释液(稀)；在第一列孔加入200ul一抗；取100ul加入第二列孔，混匀从第二列孔取100ul液体至第三列孔；。,,Company Logo,ELISA的分类,（一）直接法（二）间接法（三）双抗体夹心法（四）竞争法,,Company Logo,（一）直接法,,Company Logo,间接法的原理为利用酶标记的二抗以检测已与固相结合的受检一抗，故称为间接法。 其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应一抗的方法。可用于传染病的诊断。,（二）间接法（测抗体）,一抗,血清,,Company Logo,（三）双抗体夹心法（测抗原）,只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶标Ab而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。,Ag,血清,,Company Logo,（四）竞争法（HBcAb ）,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb， HBcAb；,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,HBcAg,wash,HBcAb,血清,,Company Logo,病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等,临床疾病诊断中的应用,蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物,ELISA在医学中的应用,,Company Logo,TMB+ H2O2 联苯醌 + 2H2O,酶催化底物液显色,,Company Logo,结果的判定,肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。而样品显色明显且逐渐变浅，根据颜色的深浅，以“”、“”表示。测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。,空白对照