蛋白质定性定量分析

2017/11/16,1,蛋白质的定性定量分析,第二章,2017/11/16,2,蛋白质的含量测定,凯氏定氮法：1883年丹麦化学家Kjeldhl建立，经后人改良后形成的一种定量测定蛋白质最为精确、敏感的方法。,原理：蛋白质的含氮量为16，只要测出样品中氮的含量，即可计算出蛋白质的含量,样品中蛋白质的含量N6.25,2017/11/16,3,凯氏定氮的基本流程：,1、消化：生物样品与浓硫酸共煮，样品蛋白质被无机化，其中氮元素转变为硫酸铵。,NH4OH+HCl NH4Cl+H2O,2017/11/16,4,2017/11/16,5,2017/11/16,6,2017/11/16,7,凯氏法的评价：,优点：,缺点：,1、适用于一切形态的样品；,2、不用比色，对混浊不透明的样品也可进行分析；,3、结果的精、准度较高。,1、样品中含有非蛋白态氮时影响分析结果；,2、组成蛋白质的氨基酸可影响分析结果；,3、操作复杂，对操作者的要求高。,2017/11/16,8,Lowry法,Lowry法原理：是在双缩脲法和Folin酚法的基础上建立的一种新的蛋白质定量方法。蛋白质在碱性条件下与铜离子反应生成紫红色络合物。然后再与Folin试剂反应生物深蓝色。颜色与蛋白质含量成正比，符合朗伯比尔定律。,2017/11/16,9,方法评价,优点,1、可对多个样品同时进行分析，操作简便；,2、结合Folin酚法，提高了分析的灵敏度；,3、结合双缩脲法，避免了Folin酚法的局限。,缺点,1、比色测定，要求显色后溶液透明，且样品必需可溶；,2、酚方式剂在碱性溶液中稳定性差，显色后需尽快比色；,3、干扰反应的因素较多。,2017/11/16,10,0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/ml,A0.80.60.40.2,2017/11/16,11,2017/11/16,12,紫外吸收法,原理：蛋白质在紫外区有两个吸收峰，其一为280nm，由芳香氨基酸上共轭双键引起，芳香氨基酸在各种蛋白质的的含量差别不大，测蛋白质溶液在280nm处的吸收值可计算出样品中蛋白质的含量。蛋白质第二紫外吸收峰在240nm以下，215nm最大，此峰是肽键引起。可通过215nm与225nm的差值计算出蛋白质的含量。,2017/11/16,13,考马斯亮蓝G-250染色法,原理：考马斯亮蓝在一定浓度的乙醇和酸性溶液中呈现红色，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰从465nm移到596nm。,优点： （1）操作简便；（2）敏感度较高（3）颜色稳定（4）对干扰剂不敏感。,缺点： （1）染料与蛋白质的实际状况复杂，色素与样品中的蛋白质不一定以当量相结合；（2）要求样品完全溶解；（3）样品不能回收使用。,2017/11/16,14,蛋白质相对分子量的测定,SDSPAGE法测蛋白质的相对分子量：带电颗粒在电场中的迁移主要受三个因素的作用，即场强、颗粒本身的电荷及分子形状。因此一般电泳无法直接测定蛋白质的分子量。加入变性剂SDS后，蛋白质变性肽链伸展且蛋白质所带电荷被SDS的负电荷覆盖，在相同的电场下，蛋白质的迁移率只与蛋白质的分子量相关。,2017/11/16,15,lgMr=lgK-bm=K1-bm,2017/11/16,16,SDS-PAGE法测定分子量的操作：,1、标准蛋白质样品的制备：按商品说明书使用。,2、待测样品的制备：取待测蛋白质样品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)1ml溶解。与标准蛋白质一起加入等体积的样品缓冲液，混匀，沸水浴加热3分钟后上样。,3、电泳分离及染色：,2017/11/16,17,4、计算相对迁移率：,2017/11/16,18,2017/11/16,19,2017/11/16,20,凝胶过滤测蛋白质分子量：测定大分子的分子量是凝胶过滤的应用之一。将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，由于加入凝胶柱的物质分子质量不同，洗脱体积也不同。可根据洗脱体积求出柱的分配常数Kav，而Kav与蛋白质分子质量之间又存在线性关系，利用这一关系可绘制出Kav与分子质量的标准曲线。,2017/11/16,21,2017/11/16,22,VeK1K2logMr,2017/11/16,23,2017/11/16,24,2017/11/16,25,方法的局限性：,1、在pH68的范围内，直线关系比较好，在极端pH时因蛋白质变性而引起偏离；,2、分子量与分配系数Kav有关，当蛋白质的轴比较大时，会引起测定偏离；,3、糖蛋白的含糖量大于5时，测得的分子量比真实分子量大。,2017/11/16,26,2017/11/16,27,沉降速度法,2017/11/16,28,沉降平衡法,2017/11/16,29,等电聚焦测定蛋白质的等电点,等电点分析：电泳结束后三氯乙酸固定并除去凝胶中的载体两性电解质，考马斯亮蓝R250染色，漂洗显带后测定蛋白质等电点。,1、利用已知等电点标准蛋白质的等电点为纵坐标，距正极的距离为横坐标作图得标准曲线，在此标准曲线上根据待测样品的位置求出其等电点；,2017/11/16,30,2、利用微电极直接测定凝胶表面的pH而得知样品的等电点；,3、将凝胶切成等距离(5nm)的小块，浸于水中，用精密试纸测定pH。以凝胶块距正极的距离为横坐标，pH为纵坐标作用图得出胶的pH梯度曲线。根据待测样品在凝胶中的位置而得出蛋白质样品的等电点。,2017/11/16,31,其它蛋白质定性定量分析技术,蛋白质的电泳染色定量分析,特定蛋白质在总蛋白中所点比例的分析：最早应用于血浆蛋白电泳分离后白蛋白和球蛋白的比例测定。其方法有二，其一是将染色后的蛋白区带剪下，用适当的溶剂提取后比色测定；其二用反射扫描仪处理后，计算各峰面积比而得出各成分的相对含量。,与已知含量的标准蛋白一起电泳染色扫描后与标准蛋白比较，得出样品蛋白的含量。,2017/11/16,32,2017/11/16,33,2017