酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）,免疫学教研室,,Company Logo,用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。,免疫荧光技术,用FITC-抗IgM单抗计数B细胞,免疫荧光技术,,Company Logo,课程内容,ELISA的原理ELISA的分类间接ELISA的具体操作ELISA在医学中的应用实例,,Company Logo,ELISA的原理,1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原或抗体的固相化 3.抗原或抗体的酶标记,E,,Company Logo,间接ELISA,实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料：包被抗原：小鼠血清 待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸,,Company Logo,操作步骤,包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4过夜,洗涤：3次，1min/次,每孔加ul!,,Company Logo,倍比稀释法与加样,稀释液,一抗试管,S1一抗原液,,Company Logo,2-12号每孔00uL稀释液，号孔加入100uL一抗，再加100uL一抗到号孔中，混匀，从号孔吸取100uL加到号孔中，混匀，号孔吸取uL，丢弃！,,Company Logo,ELISA的分类,（一）直接法（二）间接法（三）双抗体夹心法（四）竞争法,,Company Logo,间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。 其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。可用于传染病的诊断。,（二）间接法（测抗体）,,Company Logo,（三）双抗体夹心法（测抗原）,只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。,Ag,,Company Logo,（四）竞争法（HBcAb ）,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb， HBcAb；,小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,HBcAg,wash,HBcAb,,Company Logo,病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等,临床疾病诊断中的应用,蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物,非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定, ,ELISA在医学中的应用,,Company Logo,ELISA在其他相关领域中的应用,科研服务,食品安全, ,环境卫生,,Company Logo,DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2为供氢体， H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。,酶催化底物液显色,E,,Company Logo,,Company Logo,结果的判定,肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“”、“”表示。测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。,,Company Logo,结果的判定,空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅,待检样品孔显色明显,空白对照,,Company Logo,注意事项,对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢,,Company Logo,需要