分子生物学考试重点.docx

分子生物学考试宝典 名词解释 1.基因：是编码RNA或一条多肽链的DNA片段，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列插入序列。 2. 基因组：细胞或生物体内一套完整单倍体的遗传物质的总和。 3. 结构基因：基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列，包括模板链和编码链。 4. 基因表达：生物基因组中的结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等过程合成特定蛋白质，进而发挥特定生物学功能和生物学效应的全过程。 5. 开放阅读框（ORF）：在mRNA的核苷酸序列中，包含特定蛋白质多肽链信息的序列，从起始密码子开始到终止密码结束，决定了蛋白质的一级结构，该段序列称为开放阅读框或蛋白质编码区。 6. 非编码区（UTR）：是位于开放阅读框的5端上游和3端下游的没有编码功能的核苷酸序列。其主要功能是参与翻译起始调控，是翻译的必需序列。 7. 卫星DNA:是出现在非编码区的串联重复序列，其特点是具有固定的重复单位，该重复单位首尾相连形成重复序列片段，通常存在于间隔DNA和内含子中。包括，大卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。 8. 微卫星DNA：又称为短串联重复（STR），是一类更为简单的寡核苷酸串联重复序列，其重复单位为26bp，重复次数1060次左右，其总长度通常小于150bp，分布在所有的染色体。微卫星DNA因为重复单位的重复次数不同而具有高度的遗传多态性，并且按照孟德尔遗传规律，可以作为很好的遗传标记。 9. 动态突变：微卫星序列的串联重复的拷贝数可发生改变，并可随世代的传递而扩大，称为动态突变。可与一些遗传病和肿瘤发生有关。 10. 反向重复序列：是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。两个反向序列间可以有间隔序列，也可以串联在一起（回文结构）。反向重复序列常见于基因的调控区内，可能与复制、转录的调控有关。 11.限制性片段长度多态性（RFLP）：指用同一种限制性内切酶消化不同个体的DNA时，由于高度重复序列和点突变的存在，会得到长度、数量各不相同的限制性片段类型。 12. 分子克隆：在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 13. 基因工程：有目的地通过分子克隆技术，利用克隆基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造基因结构的系列过程。 14. 载体：能够携带外源基因进入受体细胞，并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的DNA分子。 15. 基因组学：意指阐明整个基因组的结构，结构与功能的关系以及基因之间相互作用的科学。 16. 功能基因组学：研究基因组中的所有基因功能的学科，是从基因整体水平上对基因的活动规律进行探讨。研究内容包括：基因组的表达，蛋白质产物的功能，基因组多样性的研究，基因组功能注释。 17. 蛋白质组学：研究细胞或机体全部蛋白质表达及其活动方式，包括：翻译后修饰，转运定位，结构变化，蛋白质与蛋白质、蛋白质与其他生物大分子的相互作用等的一门学科。 18. 操纵子：原核生物数个功能相关联的结构基因串联在一起构成信息区，连同其上游的调控区以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，其转录产物为多顺反子。 19. 操纵元件：是一段能够被不同基因表达调控蛋白识别和结合的DNA序列，是决定基因表达效率的关键元件。 20. 启动子：是RNA聚合酶特异识别和结合并启动转录的DNA序列。包括识别序列部位、结合部位、起始部位。 21. 增强子：位于真核基因中远离转录起点，能够明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列，它可以位于被增强的转录基因的上游或下游，作用无方向性和基因特异性（但有组织特异性），也不受基因间距离远近的影响。 22. 衰减子（attenuator）：位于一些操纵子中第一个结构基因之前的一段能够减弱转录作用的DNA序列。 23. CAP：是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白。这种蛋白可以将葡萄糖饥饿信号传递给许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖是可以利用其他碳源。 24. 转座子（transposon，Tn）：是细菌细胞里发现的一类除携带与转座作用有关基因外还携带有其他基因（如耐药基因，重金属抗性基因等）的转位因子。其两端侧翼序列是两个反向重复序列（IS）。可在细菌染色体、质粒和噬菌体基因组之间转移，是细菌耐药基因播散的机制。 25. 逆转录转座子（retroposon）：真核生物中的一些中度重复序列的转移成分要先转录成RNA，再逆转录成cDNA，然后重新整合到基因组中，这种逆转录旁路的转移成分称为逆转录转座子。 26. SD序列：在位于原核生物mRNA起始密码AUG上游10碱基左右，有一段富含嘌呤的序列，这一序列以AGGA为核心，成为SD序列。该序列能与核糖体30s小亚基中16s rRNA 3端 2 分子生物学考试宝典（私房版） 富含UCCU序列互补，是核糖体特异识别和结合的部位。 27. 管家基因：在生物体生命全过程都是必须的，且在一个生物个体几乎所有细胞都持续表达的基因。 28. 多基因家族：指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的基因，其编码产物常常具有相似的功能。 29. 假基因（pseudogene）：指与某些有功能基因结构相似，但不能表达基因产物的基因。 30. 癌基因：是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。当癌基因结构或表达发生异常时，其产物可以使细胞无限制增殖，导致肿瘤的发生。包括病毒癌基因和细胞癌基因。 31. 细胞癌基因：存在于正常细胞基因组中，与病毒癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的癌基因叫原癌基因，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。特点：1）存在广泛；2）高度保守；3）原癌基因是必需基因，产物有重要功能；4）在某些因素作用下可发生突变，成为癌基因。 32. 病毒癌基因：存在于病毒（大多数是逆转录病毒）基因组中能使靶细胞发生恶性转化的基因。它不编码病毒结构成分，对病毒无复制作用，但是受到外界条件激活时可以产生诱导肿瘤发生的作用。 33. 抑癌基因：存在于正常细胞内的一大类抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可以引起细胞恶性转化，从而导致肿瘤的发生。 34. 凋亡：是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序性死亡过程，它的发生受机体的严密调控。 35. 细胞周期蛋白：是一类随细胞周期的变化呈周期性出现与消失的蛋白质，可分为A、B、C、D、E等几大类，它们可在细胞周期的不同阶段相继表达，与CDK蛋白结合后，参与细胞周期相关活动的调节。 36. 周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）：是一类可以与周期蛋白结合，并将周期蛋白作为其调节亚单位，进而表现出蛋白激酶活性的蛋白质。 37. 周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白（CDKI）：是对CDK激酶起负性调控作用的蛋白质。它们在细胞周期的不同检测点或与CDK单独结合，或与Cyclin-CDK复合物结合，形成不同的屏障。其本身也可通过细胞周期中特异性的降解或失活作用，调控细胞通过细胞检查点。CDKI分为CIP/KIP家族和INK家族。 38. 转化（transformation）：质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。 3 分子生物学考试宝典（私房版） 39. 转导（transduction）：以噬菌体为媒介，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。 40. 转染（transfection）：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 41. 感染：以噬菌体、粘粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，进而感染适当细胞并在其内扩增的过程。 42. DNA变性：在理化因素作用下DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。两条链间的氢键断裂而核酸分子所有的共价键不受影响。 43. DNA复性：促使变性的因素解除后，两条DNA链通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。 44. 端粒（telomere）：是位于真核生物染色体末端的，由DNA和蛋白质组成的一膨出结构。端粒DNA由短的高度重复序列组成，重复序列在DNA复制过程中正常复制，部分由端粒酶延伸。 45. 反式作用因子：是真核细胞中含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。（反式作用因子的三个基本特征：一般具三个功能结构域：DNA结合域、转录活性域、结合其他蛋白的结合域；能识别并结合顺式作用元件；对基因表达有正性和负性调控作用。） 46. 顺式作用元件（cis-acting element）：是指那些与结构基因串联在一起，与结构基因表达调控相关，能够被基因调控蛋白特异识别和结合的DNA序列。包括：启动子、上游启动元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。 47. 锌指结构：是指在结合DNA的结构域中含有较多的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）的区域，借肽链的弯曲使2个Cys 和2个His或4个Cys与一个锌离子络合成的指状结构。具有锌指结构的反式作用因子都含有几个相同的锌指结构。 48. 亮氨酸拉链（leucine zipper）：有些反式作用因子结合DNA结构域中有一段约30个氨基酸组成的核心序列，每个6个氨基酸残基有规律的出现1个亮氨酸残基，能够形成两性-螺旋，一端为富含碱性氨基酸的亲水的碱性区域，一端为成行亮氨酸构成的疏水区（亮氨酸拉链区），两个具有亮氨酸拉链区的单体以疏水力相互作用就形成了亮氨酸拉链。 49. 转基因动物：是指基因组中整合有人工导入的外源基因、外源基因能够表达并按孟德尔定律遗传的一类动物。 50. 嵌合体（chimera）动物：体内含有两种或两种以上基因组细胞的动物；在转基因动物中，指体内部分组织细胞中整合有外源基因的动物。 4 分子生物学考试宝典（私房版） 51. 蛋白激酶：能够将-磷酸基团从磷酸供体分子上转移至底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。 52. 蛋白磷酸酶：具有催化已经磷酸化蛋白发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成磷酸化与去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。对蛋白质激酶所引起的变化产生衰减信号。 53. 丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）：属于蛋白丝/苏氨酸激酶，是接收膜受体转换与传递的信号，并将其带入细胞核的一类分子。未受刺激细胞内MAPK无活性，可因逐级磷酸化反应而激活。 54. 核酶：是一种可以催化RNA切割和RNA剪接反应的由RNA组成的酶。可以作为基因表达和病毒复制的抑制剂。 55. 基因敲除：指通过DNA同源重组定向地将外源基因替换宿主细胞染色体DNA中特定的基因，从而使特定的基因在细胞内或生物体内失活的过程。 56. 基因打靶：通过DNA定点同源重组，改变基因组中某一特定基因，从而在生物体内研究该基因功能。 57. 基因诊断：以DNA和RNA为诊断材料，利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接监测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 58. 核酸分子杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链。其实质是，核酸变性和具有同源序列的两条单链的复性过程。 59. 反义核酸技术：是通过合成一种与目标DNA或RAN特异性互补的反义核酸片段，来干扰目标基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。 60. DNA芯片技术：在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）的技术，常用计算机硅芯片作为固相支持物。 61. PCR/单链构象多态性分析（SSCP）：PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的由于构象的不同因而迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在，常用于点突变的检测。 62. 基因连锁分析：将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传标志，在同一个家系成员中探查是否存在致病基因的方法。 63. 三链DNA:一些DNA或RNA寡核苷酸片段能特异结合在的DNA的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键，这样的结构称为三链DNA。 64. 信息分子：携带生物信号，在细胞之间进行传递的小分子化学物质。又称为第一信使。 5 分子生物学考试宝典（私房版） 65. 受体：靶细胞中能够特异性结合外源信号分子，并将信号传至细胞内产生生物效应的蛋白质。与受体呈特异性结合的信号分子称为配体。受体可分为膜受体和细胞内受体，其作用特点是：高度特异性，高亲和力，可饱和性，可逆性，放大效应 66. G蛋白：即鸟苷酸结合蛋白，是由、三个亚基构成的异源三聚体，另一类G蛋白为小分子单体G蛋白。G蛋白具有结合GDP或GTP的能力，并有催化GTP成GDP的活性，广泛存在各种组织细胞膜上，在受体和效应蛋白间起传递信息的作用。 67. YAC(酵母人工染色体)：是由酵母染色体和质粒的一部分构建而成，包含了中心粒、端粒、复制元件和筛选标记等序列。这种载体能插入大片段DNA，一般认为携带1Mb的插入片段，主要是用来构建大片段 DNA 文库。 68. 粘粒（cosmid）：是由大部分质粒序列包括复制原点、抗性标记等和噬菌体的cos粘端序列构建而成，可携带较长的DNA插入片段（4050kb）。粘粒可以像噬菌体一样被包装成粒子。 69. 探针：指用放射性核素或其他标记物标记的核酸片段，具有特定的序列，能与待测核酸片段互补结合，可用于检测核酸样品中的特定基因。可分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。 70. 基因治疗：一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。 6 分子生物学考试宝典（私房版） 问答题 一、病毒、原核、真核基因组的特点 1.病毒基因组 1）病毒基因组较小，是单倍体； 2）形式多样：病毒基因组有的是DNA，有的是RNA，但只含一种核酸。结构上可以是双链、单链、环状、线性分子； 3）RNA病毒基因组可以是数条不相连的RNA链组成：如流感病毒基因组RNA有8个RNA分子组成； 4）存在基因重叠：不仅存在结构基因重叠，也存在编码区和调控区重叠； 5）可形成多顺反子mRNA； 6）噬菌体基因连续，而真核细胞病毒基因是不连续的。 2.原核基因组 1）通常由环状双链DNA分子组成，只有一个复制起点； 2）具有操纵子结构，转录产物为多顺反子； 3）绝大多数为单拷贝（编码rRNA的基因有多个拷贝）； 4）编码区所占比例较大（大于真核小于病毒），且重复序列很少； 5）含有编码同工酶的同基因； 6）不同原核生物基因组GC含量变化大，可用于鉴别细菌种类； 7）细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象； 8）细菌染色体外存在质粒DNA。 3.真核基因组 1）真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，有多个复制起点； 2）由染色体DNA和线粒体DNA组成； 3）非编码序列多于编码序列，编码序列仅占3左右； 4）存在大量重复序列； 5）结构基因多为断裂基因，有内含子和外显子组成； 6）转录产物为单顺反子； 7）存在多基因家族和假基因； 8）体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。 7 分子生物学考试宝典（私房版） 二、DNA损伤因素及机制 1.紫外线引起DNA损伤 1）形成胸腺嘧啶二聚体，影响双螺旋结构，使复制和转录受阻； 2）引起DNA间交联，DNA与蛋白质交联，甚至DNA链断裂。 2.电离辐射引起DNA损伤 1）导致碱基变化：电离辐射产生的自由基可导致碱基氧化修饰、过氧化物形成、碱基破坏和脱落； 2）导致脱氧核糖变化：自由基导致脱氧核糖分解； 3）导致DNA链断裂：直接或间接使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致DNA断裂； 4）引起DNA交联：包括DNA-DNA交联和DNA-蛋白质交联。 3.烷化剂引起DNA损伤 1）导致碱基烷基化，影响碱基配对； 2）导致碱基脱落，造成子代DNA序列改变； 3）导致DNA链断裂； 4）导致DNA交联。 4.碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变 5.DNA自发损伤 1）复制时产生碱基错配； 2）修复时产生碱基错配； 3）碱基自发改变导致DNA损伤：如互变异构移位、脱氨基、碱基丢失。 6.其他因素：如吖啶类化合物的插入，生物氧化的自由基与DNA发生加成和小自由基反应等。 三、DNA的损伤修复机制 1.直接修复 1）一些DNA断裂口在连接酶作用下可直接修复； 2）二聚体可被光复活酶直接修复； 3）烷基化碱基可通过O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶、Ada酶直接修复。 2.切除修复 1）单个碱基切除修复：特定DNA糖苷酶识别并切除受损碱基AP核酸内切酶在无碱基部位将DNA链的磷酸二酯键切开外切核酸酶 8 分子生物学考试宝典（私房版） 切除脱氧核糖残基DNA聚合酶和连接酶修复缺口； 2）核苷酸片段切除修复：先由一个酶系统识别损伤部位，然后在损伤两侧各水解一个磷酸二酯键，释放一段核苷酸，最后在DNA聚合酶和连接酶修复损伤区。 3.重组修复：是DNA损伤较多时采取的修复方式，是先进行复制再进行切除修复。包括同源重组和非同源重组。 4.SOS修复：是DNA损伤严重时的应急性修复方式，人类细胞未发现这种修复系统。 5.细胞周期检查点控制：这是真核生物诱导修复的主要机制，通过该机制可以诱导修复基因转录，或暂时阻断细胞周期，或诱导细胞凋亡。 四、基因突变的遗传效应 1.基因突变引起遗传密码的改变：发生碱基取代、缺失、插入都会引起DNA碱基组成和排列顺序的改变，但就转录、翻译合成蛋白质而言，基因突变会产生多种遗传效应。 1）错义突变：因为DNA分子中碱基的取代，导致转录翻译后蛋白质氨基酸组成和排列顺序发生改变。 2）无义突变：由于碱基被取代、缺失或插入，使原来的氨基酸密码子变成终止密码子，翻译后形成一条切短了的、不完全的多肽，使蛋白质生物活性和功能发生改变。 3）同义突变：虽然基因结构中有碱基取代，但由于遗传密码的简并性，而不引起蛋白质氨基酸组成和排列顺序发生任何改变。 4）移码突变：基因碱基序列中发生单个核苷酸、数个核苷酸的缺失或插入，或核苷酸片段的缺失或插入，导致突变区域后的阅读框移位。如果插入或缺失核苷酸是3的整数倍，合成多肽链就会增加或减少一个或数个氨基酸。如果插入或缺失核苷酸不是3的整数倍，突变区域后合成的氨基酸将完全改变，还重新产生终止密码子，影响多肽长度，严重影响蛋白质的结构、理化性质和生物功能。 2.基因突变影响hnRNA的剪接：如果真核生物基因突变发生在hnRNA的剪接位点上，导致剪接位点消失或产生新的剪接位点都将导致蛋白质表达产物的异常，改变相应的生物性状。 五、原核、真核基因表达特点 1.原核：1）操纵子模型普遍性；2）阻遏蛋白与阻遏机制普遍性；3）因子决定RNA聚合酶识别特异性；4）转录和翻译过程耦联，产物为多顺反子；5）仅一种RNA聚合酶，转录所有基因；6） tRNA和rRNA前体需要加工修饰，mRNA不需加工就可直接作为蛋白质合成模板；7）起始tRNA 9 分子生物学考试宝典（私房版） 携带的是甲酰蛋氨酸（fMet）可有多个起始部位，同时合成不同蛋白；8）核糖体直接结合到AUG部位 2.真核：1）转录和翻译分开，产物为单顺反子，转录产物需进行加工；2）转录激活主要受顺式作用元件和反式作用因子相互作用调节；3）有3种RNA聚合酶，分别转录不同RNA；4）起始tRNA携带的是蛋氨酸，就一个起始部位；5）核糖体结合与“帽子”结构，扫描找到AUG。 六、乳糖操纵子的作用机制 乳糖操纵子（lac operon）含Z、Y、A三个结构基因，分别编码-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶。结构基因上游有一个操纵元件（O）和一个启动子（P），启动子上游有一个CAP（分解代谢物基因激活蛋白）结合位点。启动子、操纵元件和CAP结合位点共同构成了Lac操纵子的调控区。I基因是调节基因，可编码产生阻遏蛋白，在没有乳糖的条件下与操纵元件结合，操纵元件与启动子有部分重叠，从而抑制结构基因的转录。 在乳糖存在时，乳糖经透酶作用进入细胞，在由-半乳糖苷酶催化生成半乳糖。半乳糖可作为诱导剂与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白构象改变与操纵元件解离，解除对结构基因转录的抑制。 Lac启动子是弱启动子，与RNA聚合酶结合能力弱，需要CAP对其进行正调控。当环境中由以葡萄糖为主转变为以乳糖为主要碳源时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，从而可以与CAP结合位点结合，激活RNA聚合酶活性，启动结构基因转录，加速合成分解乳糖的3种酶。 七、色氨酸操纵子的作用机制 色氨酸操纵子（trp operon）是一种阻遏型操纵子，含E、D、C、B、A五个结构基因，编码色氨酸合成相关酶。上游调控区由启动子（P）和操纵元件（O）组成。R是调节基因，编码阻遏蛋白，在细胞内有大量色氨酸存在时与操纵元件结合，抑制转录，无色氨酸时则不结合，启动转录。 trp操纵子的另一个调控方式是衰减机制调节。衰减子位于结构基因E和操纵元件之间的L基因中。衰减子转录物有片段1、2、3、4四个序列互补区，相邻之间可形成发夹结构。3、4形成发夹结构后紧跟着寡尿嘧啶，是不依赖因子的转录终止信号。L编码的14个氨基酸短肽序列中有两个相邻的色氨酸密码子，位于片段1内。由于细菌转录翻译偶联，当细胞中有色氨酸时可以形成色氨酰-tRNA，核糖体可迅速通过相邻两个色氨酸位点，封闭片段2，致使片段3、4 10 分子生物学考试宝典（私房版） 形成发夹结构，终止转录。当细胞中色氨酸缺乏时，核糖体就滞留在两个色氨酸密码子位点，片段2、3可形成发夹结构，不影响结构基因的继续转录。 八、反式作用因子结构域，模体及其特点 反式作用因子一般具三个功能结构域：DNA结合域、转录活性域、结合其他蛋白的结合域。与DNA结合的模体主要有： 1.锌指结构：该结构域中含有较多的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）的区域，借肽链的弯曲使2个Cys 和2个His或4个Cys与一个锌离子络合成的指状结构。具有锌指结构的反式作用因子都含有几个相同的锌指结构，每个指结构的指尖部分可以进入DNA双螺旋的大沟或小沟。 2.同源结构域：很多反式作用因子结合DNA的结构域中具有一段60左右个氨基酸组成的保守的螺旋-回折-螺旋结构区域，称为同源结构域，其螺旋区域能够进入DNA双螺旋的大沟，与碱基结合。 3.亮氨酸拉链：有些反式作用因子结合DNA结构域中有一段约30个氨基酸组成的核心序列，每个6个氨基酸残基有规律的出现1个亮氨酸残基，能够形成两性-螺旋，一端为富含碱性氨基酸的亲水的碱性区域，一端为成行亮氨酸构成的疏水区（亮氨酸拉链区），两个具有亮氨酸拉链区的单体以疏水力相互作用就形成了亮氨酸拉链，其碱性区域可以结合DNA。 4.螺旋-环-螺旋（HLH）：这种结构能形成两端具有兼性的-螺旋，螺旋间由不同长度的环连接。紧靠螺旋区N端有一段富含碱性氨基酸的序列可与DNA结合。含有该结构的反式作用因子（如与免疫球蛋白链基因增强子结合的E12和E47）易通过螺旋区形成二聚体。 5.碱性-螺旋：该结构含有高密度的碱性氨基酸，能与DNA结合，但无锌指结构、同源结构和亮氨酸拉链结构。 九、真核生物转录水平的调控机制 真核生物转录水平的调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响起始复合物形成的过程。 1.转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。 转录起始复合物形成的过程：TFD结合TATA盒RNA聚合酶识别并结合TFD-DNA复合物形成一个闭合的复合物其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放的复合物。 11 分子生物学考试宝典（私房版） 这个过程反式作用因子的作用是：促进或抑制TFD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。 2.反式作用因子的特点：1）一般具三个功能结构域：DNA结合域、转录活性域、结合其他蛋白的结合域；2）能识别并结合顺式作用元件；3）对基因表达有正性和负性调控作用。 3.转录起始的调控： 1）反式作用因子活性的调节：表达调节合成出来就有活性；共价修饰磷酸化、去磷酸化、糖基化；配体结合许多激素受体是反式作用因子；蛋白质与蛋白质相互作用复合物的解离与形成。 2）反式作用因子和顺式作用元件结合发挥调节功能：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守序列，对基因转录起调节作用。 3）反式作用因子作用方式有多种模式：成环、扭曲、滑动等。 4）反式作用因子的组合式调控使调控更精确。 十、真核生物转录后水平的调控机制 1.5端加帽和3端多聚腺苷酸化：是保持mRNA转录过程稳定，不被降解的重要因素。 2. mRNA选择性剪接亦可调控基因表达。 3. mRNA的转运机制调节进入细胞质的mRNA量。 十一、受体的功能、特点和类型 1.功能：特异性结合外源信号分子，并将信号传至细胞内进而产生生物效应。 2.特点：高度特异性、高亲和力、可饱和性、可逆性、放大效应。 3.类型：膜受体和胞内受体。 膜受体主要是传递水溶性信号分子，又可分为：1）离子通道受体：此类受体主要结合神经递质，使离子通道打开或关闭，改变膜的通透性，能迅速、准确低传递神经冲动，但作用时间短；2）G蛋白偶联受体：通过G蛋白影响AC或PLC等改变第二信使浓度，实现跨膜信息传递。分布广泛，主要参与细胞物质代谢的调节和基因转录的调控；3）单次跨膜受体：全为糖蛋白，主要有酪氨酸蛋白激酶受体（胰岛素受体、表皮生长因子受体等）和非酪氨酸蛋白激酶受体（白介素受体、干扰素受体、生长素受体等）。主要与细胞增殖、分裂、分化及癌变有关。 胞内受体多为反式作用因子，主要结合脂溶性信号分子，如：类固醇激素、甲状腺素、维甲酸等。 12 分子生物学考试宝典（私房版） 十二、G蛋白循环 受体与信号分子结合后，受体构象改变，结合G蛋白并使其构象改变，使GTP置换了GDP。 G蛋白激活后，离开受体并解离成亚基和亚基GTP复合物，亚基通过调节AC、PLC等活性，调节细胞内cAMP等第二信使的浓度，从而把信号传导给下游分子。 同时，亚基水解GTP为GDP，然后亚基GDP复合物重新与亚基结合形成无活性的三聚体，完成一次信息传导。 十三、cAMP信号传导途径 该途径以靶细胞内cAMP浓度改变和激活PKA为主要特征，是激素调节物质代谢的主要途径。信息传递过程为：细胞外信号物质受体G蛋白ACPKA酶或功能蛋白质生物学效应 1）不存在受体激动剂时，G蛋白的3个亚基呈聚合状态，亚基与GDP结合。 2）存在激活性配体如肾上腺素时，受体与之结合，受体构象改变，暴露出与G蛋白结合的部位，G蛋白与配体-受体复合物结合，导致G蛋白与GDP结合力下降，释放GDP。 3）在Mg2+存在下，GTP取代GDP使亚基暴露与AC结合位点，结合并激活AC。 4）AC催化ATP生成cAMP。 5）GTP与亚基结合几秒后被亚基的GTP酶活性催化为GDP，亚基与亚基重新结合，关闭信号使AC失活。 6）cAMP作为第二信使激活PKA，后者进而激活其他靶酶或直接间接激活反式作用因子（CREB），调节基因表达。 当生长激素抑制素等与相应受体结合可结合偶联i-G蛋白，i亚基可直接抑制AC活性，同时游离的亚基可与s亚基结合抑制对AC的活化作用，使AC活性下降。 十四、胰岛素受体途径 胰岛素受体由2个亚基和2个亚基组成。配体结合在亚基部位，亚基具有内在的酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性。 （一）IR介导的IRS-1RasMAPK信号通路1) 配体与受体的结合导致受体变为二聚体结构，进而导致其发生自身磷酸化，并磷酸化IRS-1(胰岛素受体底物1)蛋白； 2）IRS-1可结合Grb2蛋白（接头蛋白，含1个SH2结构域和2个SH3结构域），进而结合并 13 分子生物学考试宝典（私房版） 活化调控分子SOS（小分子单体G蛋白调节因子GEF的一种）； 3）SOS促使Ras释放GDP并结合GTP，使Ras激活，然后激活的Ras脱离SOS蛋白。 4）活化的Ras进而活化Raf，Raf是一种MAPKKK,可逐步激活MEK（MAPKK）ERK1（MAPK），完成MAPK的级联活化； 5）活化的ERK1转位至核内，作用于一些转录调控因子，影响基因的表达。 （二）IR介导的IRS-1PI3KPKB途径PKB是一种与PKA、PKC有很高同源性的蛋白苏/丝氨酸激酶，是原癌基因c-akt产物，能被PDGF、EGF、Insulin等激活。 1) 配体与受体的结合导致受体变为二聚体结构，进而导致其发生自身磷酸化，并磷酸化IRS-1(胰岛素受体底物1)蛋白； 2）磷酸化的IRS-1通过SH2与PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）的p85亚基结合，激活p110催化亚基； 3）PI3K催化PIP2生成PIP3（磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸）； 4）PIP3与蛋白激酶PDK1共同激活PKB； 5）PKB磷酸化目标底物，介导代谢调节、细胞存活等效应。 十五、IP3、DAG在信号传导中的作用（磷脂酰肌醇途径） 1）信号分子与受体结合，引起受体构象变化； 2）受体活化G蛋白（结合GTP，亚基与亚基解离）； 3）活化的G蛋白激活磷脂酶（PLC）； 4）PLC水解PIP2生成IP3 和DAG； 5）IP3 使钙通道打开，细胞内Ca2+升高； 6）Ca2+与DAG共同激活PKC； 7）Ca2+与CaM结合，激活多种蛋白激酶和蛋白磷酸酶。 十六、细胞周期的调控 细胞周期的调控主要是多蛋白参与的，针对细胞周期四个主要关卡的调控过程。 1.参与蛋白：1）周期蛋白（cyclin)；2）周期蛋白依赖性激酶（Cdk）；3）Cdk 抑制因子（CKI）；4）Rb蛋白及E2F-DP1转录因子；5）调节Cdk磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶；6）泛素和催化蛋白泛素化的酶。 14 分子生物学考试宝典（私房版） 2.四个关卡：G1晚期的限制点、G1-S转折、G2-M转折、M-G1有丝分裂关卡。 1）G1晚期的限制点：主要监控细胞大小及环境中是否有生长因子，细胞生长到足够大，并且成功完成DNA复制准备工作，才可通过限制点。细胞受到生长因子刺激在G1中期表达cyclin D，G1晚期期表达cyclin E分别与Cdk4/6 和Cdk2形成复合物复合物使Rb蛋白磷酸化而释放转录因子E2F靶基因表达，不再依赖生长因子通过限制点。（限制点决定细胞的3种命运：通过限制点继续增殖细胞；分化并进入G0期，适宜条件可重新激活增殖；丧失增殖能力，停留在G0期直至死亡。） 2）G1-S转折和S期调控：通过限制点的细胞做好DNA复制准备就可通过G1-S转折，开始DNA复制，进入S期。G1-S转折关卡主要监控DNA是否受损。P53可通过促进细胞周期抑制物p21蛋白的表达，阻止受损细胞通过G1-S关卡。或通过促进BAX、EGF-BP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、FAS等基因转录促进已通过G1-S关卡的受损细胞发生凋亡。进入S期的细胞开始表达cyclin A并结合活化Cdk2，启动DNA复制。 3）G2-M 转折和M期的调控：G2-M 转折关卡主要监控DNA是否受损及DNA是否已经正确完全地复制。 G1后期开始表达cyclin B，cyclin B与Cdk1结合，在G2-M转折处，Cdk1被磷酸酶Cdc25C 去磷酸化而活化cyclinB-Cdk1,导致底物蛋白（组蛋白1、核纤层蛋白等）的磷酸化，细胞通过G2-M关卡。如果细胞DNA受损或复制不完全激活传感器蛋白并与受损DNA结合激活ATM和ATR磷酸化Chk2和Chk1（关卡激酶）磷酸化 Cdc25C磷酸化的Cdc25C和被14-3-3结合并运出细胞核Cdk1无法被活化，细胞停滞于G2期。 细胞进入M期MPF（促有丝分裂因子，即cyclinB-Cdk1）激活分裂后期促进复合体（APC）分裂抑制因子泛素化而降解姐妹染色体分离 APC促进cyclin B降解细胞核重形成，胞质分裂，产生两个子代细胞。 4）M-G1有丝分裂关卡：该关卡主要监控姐妹染色体是否稳定地附着在纺锤体上。M期的cyclinA/B-Cdk1可使结合在纺锤体处的APC磷酸化而活化，最终导致连接染色体的蛋白质降解。细胞通过关卡进入G1期。 十七、抑癌基因在细胞周期的调控机制与肿瘤发生机制之间的关系 1.RB：RB的作用机制是通过与转录因子E2F-DP1结合，控制细胞无法通过G1-S关卡。RB家族已发现的3个成员，RB、P107、P130分子中都有个口袋结构能与E2F-DP1结合抑制它的转录活性。在G1中期及晚期，Cyclin D-Cdk4/6和Cyclin E-Cdk2先后磷酸化RB。磷酸化的RB失去活性， 15 分子生物学考试宝典（私房版） 释放E2F-DP1启动靶基因转录，包括：1）Cyclin D、E、A、Cdk2基因；2）某些癌基因；3）E2F基因本身。E2F基因的表达加速RB释放E2F-DP1，也使细胞完成完成DNA的复制准备，细胞通过G1-S关卡。RB基因表达异常可失去对细胞增殖的控制，诱发肿瘤。 2.P53: p53蛋白是核内的转录因子，其一个重要的靶基因编码p21蛋白。p21蛋白是G1期特异的细胞周期抑制物，作用是阻止细胞通过G1-S关卡。其另一个靶基因GADD45编码DNA修复蛋白，与p21共同作用使受损细胞不再分裂，并修复损伤维持基因组稳定。同时p53还可以促进BAX、EGF-BP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、FAS等基因转录促进已通过G1-S关卡的受损细胞发生凋亡。P53通过上述两种途径使细胞周期停滞，起着稳定基因组和抑制突变细胞产生的作用，从而抑制肿瘤的发生。 十八、细胞凋亡的基因调控 1.死亡受体途径（外源性）：哺乳动物细胞表面至少有8种死亡受体：Fas、TNFR1、TNFR 2、DcR1、DcR 2、DR3、DR4 、DR5。它们都属于TNF家族成员。 以Fas为例：Fas结合Fas LFas形成三聚体，激活死亡结构域（DD）募集接头蛋白FADD（也含有DD）Fas-FasL-FADD形成死亡诱导信号复合物（DISC），FADD的死亡效应域（DED）被激活通过DED 募集caspase 8前体caspase 8自我激活激活caspase 3细胞凋亡 2.线粒体途径(内源性）：通常在生长因子缺乏、生长环境不适、化学物质或射线导致DNA损伤后发生，细胞色素C进入胞浆是关键步骤，需要调节蛋白Bcl2家族参与。 （线粒体释放细胞色素C的3种模式：Bax和Bak在线粒体外膜上打孔；通过线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道（VDAC）；它们使线粒体外膜上天然存在的ATP-ADP转运蛋白孔道保持开放，使细胞色素C从线粒体外膜间隙进入胞浆） 进入胞浆的细胞色素C与Apaf 1、ATP/dATP结合形成凋亡体Apaf 1通过胱天蛋白酶募集域（CARD）与caspase 9前体的CARD作用募集caspase 9前体富集的caspase 9自我激活激活caspase 3 细胞凋亡。 3.凋亡有正负调节和两条凋亡途径的串话 1）正调节：caspase 8、 caspase 9前体的自我激活和caspase的级联酶促放大效应。 2）负调节：FLIP抑制caspase 8前体的活化；Bcl-2家族中抗凋亡成员阻断促凋亡成员；胞浆中存在的能抑制caspase的凋亡抑制物（IAP）。 3）两条途径串话：caspase8不仅能活化下游caspase，还能切割促凋亡因子Bid，使其活化并结合到线粒体，促进Bax或Bak的活化，进而促进细胞色素C的释放，活化内源凋亡途径。 16 分子生物学考试宝典（私房版） 十九、DNA聚合酶的作用 1.DNA聚合酶(全酶)：具有53聚合酶活性、53外切酶活性、35外切酶活性（校正活性）。 主要应用：1）催化DNA缺口平移反应；2）对双链DNA 3突出末端进行末端标记;3)第二cDNA链合成;4)Sanger 测序 2.klenow聚合酶：具有53聚合酶活性、35外切酶活性缺失53外切酶活性。 主要应用：1）对双链DNA 3突出末端进行末端标记；2）第二cDNA链合成；3）Sanger 测序；4）随机引物法标记法 3.Taq DNA聚合酶：具有DNA依赖的53聚合酶活性、53外切酶活性、末端脱氧核苷酸转移酶活性（3加尾）、逆转录酶活性。 主要应用：1）PCR反应扩增基因；2）平末端加A尾，用于T-A克隆 二十、大肠杆菌表达系统中外源基因表达的条件及影响因素（条件优化） 1.表达条件 1）应选用大肠杆菌表达载体。该载体应具有：有自己的复制子；有多克隆位点；具有可供选择的遗传标记；有足够的容量；可通过特定的方法导入宿主菌；配备与大肠杆菌相适宜的完整表达盒，可诱导启动子、转录子、SD序列等。 2）来自真核细胞的目的基因要适当改造。目的基因必需是cDNA，起始密码子(ATG)上游的非编码序列或信号肽序列应去除。 3）目的基因与载体可以按不同方式连接。目的基因连接在起始密码后可用于表达非融合蛋白。表达融合蛋白时可将目的基因连接于原核基因编码序列。 （融合蛋白的优点：稳定，不易被细菌蛋白酶水解；可产生分泌型产物；可利用针对融合蛋白原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化；原核蛋白部分可用蛋白酶切除，释放真核蛋白） 4）选择适当的受体菌株和诱导条件：根据启动子类型和特定蛋白质选择表达效率高的菌株。 2.影响因素 1）选择可调控的强启动子； 2）引入原核增强子样序列； 3）设计合理的SD序列并调整SD序列与ATG之间的距离，增强核糖体和mRNA的结合程度； 4）使用大肠杆菌优势密码子或共表达稀有密码子的tRNA基因； 17 分子生物学考试宝典（私房版） 5）增加mRNA的稳定性，5端加入“发夹”结构，3端加入重复性基因外回文序列（REP）； 6）提高表达产物的稳定性：分泌表达；与细菌固有蛋白融合表达；改造蛋白酶识别位点；使用蛋白酶基因缺陷细菌；共表达蛋白稳定辅助因子（HSP、分子伴侣基因等） 二十一、良好载体的条件 1.带有复制子（DNA聚合酶识别位点），能在宿主细胞内携带外源基因一同复制； 2.载体必须带有多克隆位点（MCS），以供外源DNA插入； 3.载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性和阴性重组子； 4.载体分子必须有足够的容量； 5.可通过特定的方法导入宿主； 6.对于表达载体要有与宿主细胞相适应的能使外源基因表达的完整表达盒。（如：启动子、增强子、加尾信号，终止信号，SD序列等） 二十二、逆转录病毒的优缺点 1.优点：1）高效地感染分裂的宿主细胞（100）；2）在感染后，能将前病毒基因组稳定地整合到宿主基因组的随机位点上；3）利用重组逆转录病毒能将目的基因传递给整个细胞群；4）宿主范围广，可以感染多种人和宿主细胞；5）不产生任何有免疫原性的病毒蛋白，对宿主细胞无毒性作用，可建立细胞系长期持续表达外源基因。 2.缺点：1）只能整合到分裂相的细胞；2）容量小（不超过10kb）；3）病毒滴度不高；4）随机整合，有激活癌基因的潜在危险。 二十三、腺相关病毒载体特性及其应用前景 腺相关病毒是一类单链线状DNA缺陷型病毒。 1.优点：1）是非病原微生物,未发现野生型AAV与人类疾病有关;2）宿主范围广，它既能感染分裂细胞,又能感染非分裂细胞；3）携带的外源基因可长期存在,稳定表达，且受周围基因调控；4）可定点整合在人19号染色体上，插入突变的危险性相当低。 2.缺点：1）只能包装小于5kb的目的基因片段，相对转基因能力受限；2）整合时需要辅助病毒感染才能进行复制，增加包装的难度；3）很难大量生产；4）感染效率较逆转录病毒低；5）4080成人人感染过该病毒，可能会引起免疫排斥。 3.应用前景：AAV载体在多种组织都进行了成功的转染,如肝、脑、心肌、骨骼肌、视网膜和气 18 分子生物学考试宝典（私房版） 道上皮等组织未发现对机体有致病性。 AAV载体能转染非分裂期细胞和持久表达转基因产物的特点,适用于人造血干细胞基因转染，用于治疗血液系统疾病。另外在治疗帕金森氏综合症,杜氏肌营养不良,肺囊状纤维化等疾病方面也有良好的应用前景。 二十四、基因功能分析的三大策略 特定基因功能研究的基本策略：通过特定基因的导入和特定基因的剔除或表达的抑制，制备模式生物体或体外培养的细胞模型，观察和检测其表型（包括整体、细胞、分子水平）的变化，从而分析、鉴定特定基因的功能。 基因功能研究的工具包括动物模型和模式生物。如转基因动物、基因转染细胞等。 采用的技术有基因转移、基因敲除、RNA干扰等技术。 1. 转基因模型的应用 1）利用转基因动物分析特定基因功能：确定特定基因的功能；发现新的基因功能或未知基因的功能；发现新基因（突变）；研究基因表达的时空性；建立外源基因表达、调控的动物模型；产生需要的器官或组织；用于只在胚胎期表达的基因结构和功能的研究。 2）利用转染细胞模型研究特定基因：通过将目的基因转移入细胞中，建立细胞模型，以研究目的基因的功能。也可将转染的细胞植入生物体内，研究基因的功能。 2. 基因敲除模型的应用 基因敲除（gene knockout）是目前在体内研究基因功能的最佳方法，指通过