腺病毒宣讲材料20110731

诺赛基因腺病毒服务,2011年7月26日,Outline,腺病毒腺病毒载体腺病毒载体的应用Adxsi重组腺病毒载体系统腺病毒载体的质检如何使用和操作病毒,腺病毒,结构组成分类基因组感染细胞机制腺病毒细胞转化作用,腺病毒的结构组成,直径6090nm20面体，无囊膜240个六邻体12个五邻体双链线性DNA基因组,分类,5型腺病毒的基因组结构示意图,腺病毒基因组重要组件,E1,E2,E3,E4,5 ITR,3 ITR,ITR：反向末端重复序列E1： 激活其他病毒基因的转录，对细胞基因的转录也有调控作用E2：调节病毒DNA的复制E3：逃避宿主免疫系统对受病毒感染细胞的清除作用E4：与病毒DNA复制，晚期基因表达，RNA剪接和阻止宿主细胞生物合成等功能有关L1L5：晚期基因主要编码病毒的结构蛋白,腺病毒的感染细胞过程,先结合CAR，再结合整合素内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体 从溶酶体中释放腺病毒颗粒转位到细胞核 通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内 转录，复制，病毒包装在细胞核中进行。,腺病毒的细胞转化作用,E1A蛋白与RB105蛋白作用，55kD的E1B基因产物与P53作用，这两种复合物的形成使细胞失去生长控制19kD的E1B蛋白可能与抑制腺病毒转化细胞的凋亡有关。293细胞为Ad5 DNA片段转化的细胞，其基因组含有腺病毒DNA左端的11。,腺病毒载体,腺病毒作为载体的优点与其他病毒载体比较腺病毒载体的改造,腺病毒作为载体的优点,广泛的细胞感染范围不整合基因组非致病的病毒能得到较高的病毒滴度容易构建，容易改造不随生殖种系遗传,与其他病毒载体比较,腺病毒载体的改造,去掉了E1：（由293细胞反式提供）去掉了E3：与病毒引起的细胞免疫反应相关，不影响病毒成长可插入约7.5kb的外源DNA片段（insert）,腺病毒载体的其他改造,第二代腺病毒（去掉了E2或E4）第三代腺病毒（几乎去掉了腺病毒所有基因）Ad5-F35 （5型fiber换成35型fiber）Ad5-F3 （5型fiber换成3型fiber）溶瘤型腺病毒（保留了E1区部分基因）条件复制型腺病毒（由条件启动子启动E1）,腺病毒载体的应用,腺病毒载体应用的领域腺病毒载体应用过程中的瓶颈,腺病毒载体的应用领域,基因转染蛋白表达基因治疗腺病毒疫苗细胞移植iPS,腺病毒载体应用的瓶颈,病毒靶向性问题病毒的免疫原性为题,Targeting Ad-vetors,Genetic modification of viral coat proteins Tumor-specific promoters Conjugation with targeting ligands or polymers,Eluding AdenoviralVector Immunity,ImmunosuppressionImmunomodulationserotype switchingUse of targeted Ad vectorsmicroencapsulation of Ad vectorsuse of helper-dependent (HD) Ad vectorsdevelopment of nonhuman Ad vectors,Adxsi载体系统,腺病毒载体构建流程Adxsi载体系统特点与其他载体系统的比较常用穿梭载体介绍,重组腺病毒的构建流程,病毒载体构建病毒包装，小量扩增病毒大量扩增及纯化滴度测定,Adxsi载体特点,Ad5型E1、E3缺陷的腺病毒直接连接的方案（I-Ceu I,I-Sce I双酶切）重组克隆阳性率高能包装对细胞有毒性的基因或者对病毒包装复制扩增等有干扰作用的基因病毒滴度高,与其他载体系统比较,体外直接连接（Clontech公司 Adeno-X系统）细菌内同源重组（Adeasy系统）293细胞里面同源重组（本元正阳Admax系统）体外同源重组（invitrogen公司，ViralPower系统）,常用穿梭载体介绍,各种报告基因的载体各种标签的载体诱导表达穿梭载体系统iPS相关载体系统,2A载体构建流程,iPS相关腺病毒载体,腺病毒载体的质检,穿梭载体的质量检测 -酶切、测序、PCR病毒载体的质量检测 -酶切、测序、PCR病毒包装过程检测 -镜下观察、CPE病毒的质量检测 -滴度测定、PCR、RCA及纯度检测,CPE早期,CPE晚期,滴度测定方法介绍,OD260法空斑形成法TCID50法,VP,PFU,IU,VP：病毒颗粒（viral particle），包括“活”病毒和“死”病毒，用OD260法测定PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），梯度稀释法测定IU：感染单位（infectious unit）， TCID50法测定。,OD260法,(OD260) x (viral dilution) x (cuvette dilution) x 1.1 x 1012 =_OPU/mL只适合测定纯化的腺病毒,TCID50法,T =10 1 + d ( S - 0.5 )d = Log 10 of the dilution (= 1 for a ten-fold dilution).S = the sum of ratios (always starting from the first 10-1 dilution)= 1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0 = 6.8Titer: T=10 1 + 1 ( 6.8 - 0.5 )= 10 7.3(for 100 uL aliquot of virus) T =10 8.3 (equivalent to 2 x 108) TCID50 / mL Ta10bTCID50/mla10b-0.7PFU/ml = 1 x 10 8.3 - 0.7 PFU / mL = 1 x 10 7.6 PFU / mL = 4 x 107 PFU/mL,各种方法比较,RCA的定义,复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，简称RCA）： 是在用含腺病毒绝大部分基因组的骨架质粒与携带外源基因表达框的穿梭质粒在293细胞或细胞内同源重组产生腺病毒载体的过程中，重组腺病毒的基因组与整合在293基因组上的E1基因同源序列间发生同源重组而产生的。同源重组导致目的基因丢失而被E1区代替。RCA的特征： 在本不支持复制缺陷型腺病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上可复制和扩增，产生细胞病变，并可形成噬斑。,RCA: replication competent, infectious particle,IU: replication defective, infectious particle,non-infectious particles,腺病毒载体最终制品中的病毒粒子类型,VP: all vector particles,RCA 是如何产生的？,Homologous overlap between 293-E1 and vector backbone, 450 bp,E1 in 293 genome,Transgene cassette,E1 from 293 genome, 1100 bp,如何检测RCA,细胞法：在不支持复制缺陷型腺病毒载体增殖的细胞如A549上进行检测，用噬斑形成的数量来反应制品中RCA的含量。PCR法：设计针对E1区的引物，可以特异地检出携带E1A区基因的RCA病毒粒子。,如何降低制品中的RCA？,现在广泛应用的腺病毒重组系统（如AdMAX，AaEasy）都不可避免地会产生RCA。近来，荷兰一家公司建立了一株新的称为PERC6的腺病毒包装细胞株，这种细胞基因组上整合的腺病毒基因成分与腺病毒载体骨架没有同源区，用这种细胞生产复制缺陷型腺病毒载体理论上不会产生RCA。我们能做的就是控制病毒在293细胞中扩增的代次。,如何使用和操作腺病毒,需要注意哪些安全措施？如何确定我的细胞是否适合感染？什么是MOI，如何测定最适MOI？感染细胞的流程病毒使用过程中的常见问题,需要注意哪些安全措施,橡胶手套，口罩，护目镜，安全柜液体废弃物用84处理过再高压处理固体废弃物用可高压的袋收集后高压处理,什么是MOI？,MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数。 传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。,如何测定最适MOI？,要得到最佳的实验结果，确定腺病毒的最佳用量是非常重要的。如果用量不足，那么不能达到100%的感染效率，如果用量太高，会对细胞有毒害作用或者其他不可预测的效应。我们应该尽量用最小浓度的病毒来达到100%的基因传递效率。这个最佳的浓度因不同的细胞类型而有显著差异。为了确定你的细胞系的最适病毒用量，可以用带报告基因的腺病毒做预实验，如AdCMV-gal 或者 AdCMV-GFP。用不同稀释倍数的报告基因病毒感染细胞，在感染1-2天后检测感染效率。可以通过-gal染色或者通过在荧光显微镜下观察细胞的GFP的表达情况来确定可达到100%感染效率但又不会引起细胞表型变化病毒浓度范围。,感染细胞的流程,培养细胞至7080左右进行感染 用2ml含10%FBS血清的培养基稀释病毒（病毒用量参照最适MOI值）吸取原来六孔板中培养基的旧的培养基。加入稀释病毒的培养基。5CO2培养箱中培养如果细胞状态不好可以考虑第二天更换培养液，状态好的话可以不用换,培养细胞至7080左右进行转染 用1ml无血清的培养基稀释病毒（