《原代细胞培养实验》PPT课件.ppt

原代细胞培养实验 费晓芳 掌握无菌操作技术 了解小鼠解剖操作技术 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 了解培养细胞的消化分散 了解细胞计数方法 了解倒置显微镜的使用 实验目的和要求 实验原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出 分散成单细胞 在人工条件下培养使其生存并不断生长 繁殖的方法 借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖 细胞的接触抑制 以及细胞的衰老 死亡等生命现象 实验内容 动物的选择 选择大约一半足孕时间的胚胎 10 13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞 成纤维细胞可从这些细胞衍生获得 每组小鼠胚胎2 5个 实验材料 每组的超净台中有以下物品 1 50ml配制好的RPMI1640培养液1瓶 8ml小牛血清 FCS 1瓶 100ml0 25 胰蛋白酶1瓶 PBS 1瓶2 100ml灭菌烧杯2个 3 50ml离心筒2个4 灭菌培养皿1个 细胞培养瓶1个4 1ml 200 l移液器各1支 枪头盒2个 无菌玻璃搅拌棒1个5 细胞计数板1块 6 灭好菌的镊子1把 剪刀1把 7 酒精灯1台 试验操作步骤 1 胚胎的分离 适用哺乳动物 仓鼠 小鼠和大鼠 a 采用认可的方案处死啮齿动物 b 立即在无菌超净台内用70 乙醇擦洗整个动物 c 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口 用无菌镊子将皮肤扯向后腿 d 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部 取出含有胚胎的子宫 置于无菌的培养皿上 e 剔除胚胎周围的包膜 将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中 f 漂洗胚胎 去掉PBS 继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止 仔细清洗小鼠腹部 2 将1 2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中 用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎 用PBS漂洗 3 在无菌状态下 将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离心筒中 加入40ml0 25 的无菌胰蛋白酶 用搅拌棒轻轻搅动 4 在温暖的环境中或置于37 C培养箱中轻轻摇动15分钟 5 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降 将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中 该管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活 胰蛋白酶 6 加人新鲜胰蛋白酶溶液 见前述步骤 于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中 重复步骤4和5 7 离心混合的细胞悬液 1200r rain 5分钟 弃上清 8 用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞 按步骤7再次离心 9 用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止 10 用含有10 牛血清和抗生素 如青霉素 链霉素 的DMEM GIBCO BRL lOml再悬沉淀 并使终体积为20ml 11 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降 可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块 12 为确定现有细胞浓度 加入0 2ml细胞悬液于1 8ml1 醋酸溶液中以裂解红细胞 用血细胞计数器进行细胞计数 细胞记数方法见传代培养课件 13 按每细胞瓶Ix106细胞的数量接种于10ml组织培养液中 在饱和湿度的37 C02培养箱中孵育直至细胞铺满 14 24小时后即可观察 细胞记数 1 按上述方法 用胰蛋白酶处理细胞 细胞重悬于细胞培养液中 2 用沾有70 酒精的棉球擦净细胞计数板和盖玻片 盖玻片放好在细胞计数板上 3 用移液器吸取细胞标本10 l 加入10 l台盼氏兰溶液混匀 吸取10 l混合液从盖玻片的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间 4 在显微镜下 计数或细胞 5 计数细胞计数板每一小室中 上下左右角和中间的大方格中 5个格 的细胞数 6 在取一细胞样品 同上在细胞板的另一小室计细胞数 7 合计10个大方格中的细胞 算出1 10 3ml的细胞数 每个大方格1 10 4ml 10个大方格 10 3ml溶剂 细胞总数乘以1000即得每毫升计数细胞悬液的细胞数