免疫学概论复习

免疫学概论复习,第一章 绪论,一、免疫的基本概念与功能 二、免疫的类型 三、免疫学发展简史,一、免疫的概念与功能,1. 概念1）在微生物学和病毒学上-免除瘟疫 2.）在医学上-机体接触抗原性异物的一种生理反应3）免疫的现代定义-机体针对外源物质的一种反应，其作用是识别和排除抗原性异物，以此维持机体的生理平衡。,3. 免疫应答,1）概念：机体对抗原性异物的回应初次应答再次应答和免疫记忆免疫应答对抗原的高度特异性免疫系统对自身抗原的耐受 免疫耐受：对自身组织表达的抗原决定簇的不识别是一个主动的过程。机体在胚胎时就清除活失活了可能识别自身抗原的T淋巴细胞。,4. 免疫的三大功能及表现,5. 免疫的主要特征,1）识别非自身抗原的能力2）对不同抗原的高度特异性3) 免疫记忆能力4）对自身抗原的免疫耐受,二 . 免疫的类型,1. 天然免疫（非特异性免疫）2. 获得性免疫（特异性的免疫）,1. 天然免疫,特点：（1） 出生时已具备（早） （2） 可稳定性遗传给后代 （3） 作用广泛:无特异性 （4） 个体差异不大防御机制 （1）体表屏障 （2）内部屏障，如 干扰素、吞噬细胞及吞噬作 用、补体、溶菌酶,2.获得性免疫,特点：（1）出生后受抗原刺激产生 （2）具有特异性（针对性） （3）一般不能遗传 （4）多样性 （5）具有记忆性功能：体液免疫：B细胞 浆细胞 Ab 细胞免疫： Ag APC T细胞 致敏T细胞、淋巴因子,Ag,第二章 免疫器官与免疫细胞,免疫系统: 由具有免疫功能的器官、组织、 细胞和分子组成，是机体免疫机制发生的物质基础 分三个组织层次: 中枢免疫器官； 外周免疫器官； 免疫细胞,2.1 免疫器官的结构和功能,定义: 实现免疫功能的器官或组织分类: 根据发生的时间顺序和功能差异，可分为中枢神经免疫器官和外周免疫器官。,1.中枢免疫器官,组成: 骨髓、胸腺、鸟类法氏囊或其同功器官 功能: 主导免疫活性细胞的产生、增殖和分化成熟，对外周淋巴器官发育和全身免疫功能 起调节作用。,胸腺的免疫功能,驯化T淋巴细胞: 双阴细胞 双阳细胞 单阳细胞分泌胸腺激素, 促进T淋巴细胞的分化和成熟其它功能: 调节机体免疫平衡,维持自身的免疫稳定性,（二）腔上囊,腔上囊又称法氏囊，是鸟类动物特有的淋巴器官，位于胃肠道末端泄殖腔的后上方。功能: 训化B细胞成熟，主导机体的体液免疫功能。将孵出的雏鸡去掉腔上囊，会使血中球蛋白缺乏，且没有浆细胞，注射疫苗亦不能产生抗体。人类和哺乳动物没有腔上囊，其功能由相似的组织器官代替，称为腔上囊同功器官；曾一度认为同功器官是阑尾、扁桃体和肠集结淋巴结，现在已证明是骨髓,（三）骨髓,骨髓是成年人和动物所有血细胞的唯一来源，各种免疫细胞也是从骨髓的多能干细胞发育而来。 骨髓的主要功能是产生血细胞，近来证明骨髓还是腔上囊同功器官。在骨髓异常时，累及的不单是体液免疫，其他免疫功能也发生障碍。,二、外周免疫器官,组成: 淋巴结、脾和粘膜相关淋巴组功能: 是免疫细胞聚集和免疫应答发生的场所。,(二) 脾,功能: 在胚胎期是重要的造血器官; 出生后造血功能停止，但仍然是血细胞尤其是淋巴细胞再循环池的最大储库和强有力的过滤器； 与淋巴结相似，脾还是发生免疫应答的重要基地 产生抗体，脾富含B细胞和浆细胞，因此是全身最大的抗体产生器官，尤其是产生IgM和IgG 分泌体液因子，脾可以合成补体（C5和C8等）和备解素等重要的免疫效应分子；还能产生一种白细胞激肽，促进粒细胞的吞噬作用。,2.2 免疫细胞,T淋巴细胞B淋巴细胞第三群淋巴细胞,1. T淋巴细胞,定义:由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成, 由于它在胸腺内分化成熟称为T细胞.成熟后移居于周围淋巴组织中。 T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志，这些分子为抗原性不同的糖蛋白,与T细胞对抗原的识别,细胞的活化,信息的传递.细胞的增殖分化和功能表达有关, 故为T细胞的表面标志(CD), 可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。,TCR,CD28,CD4/CD8,IL-2R,CD2,T 细胞膜表面分子,CD3,CD152（CTLA-4）,CD154（CD40L）,CD11a 黏附分子,T细胞表面抗原识别受体,T细胞在胸腺内的发育,T细胞库： 在一个体内能特异性识别各种抗原 的T细胞克隆的总数 成熟的T细胞库特征： 1. 识别抗原时的自身MHC分子限制性 2. 对自身抗原的耐受性,2.B淋巴细胞,来源于骨髓的多能干细胞。在禽类是在法氏囊内发育生成，故又称囊依赖淋巴细胞（bursa dependent lymphocyte）/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞，是由骨髓中的淋巴干细胞分化而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。B细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。B1细胞为T细胞非依赖性细胞。B2为T细胞依赖性细胞。B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存在。,CD80/86,CD40,FcmR,CD32,BCR,MHC-II,B 细 胞 膜 表 面 分 子,CD19,CD20 （离子通道）,CD79a,CD79b,CD21,CD23,B淋巴细胞抗原识别受体,BCR与TCR的比较,BCR TCR结构 BCR-Ig, TCR-CD3结合形式 抗原-BCR 抗原-MHC-TCR结合抗原 游离抗原 MHC-抗原肽 与任何蛋白质抗原应答 MHC-肽应答识别表位 空间构像决定簇 线性肽片段,B细胞的功能,1. 产生抗体2 . 提呈抗原3. 分泌细胞因子参与免疫 调节 炎症反应和造血,B细胞的发育,分两个阶段: 抗原非依赖期 (中枢免疫器官) Pro-B Pre-B 不成熟B 成熟B 抗原依赖期 (外周免疫器官) 抗原 成熟B 浆细胞,B细胞在骨髓内的发育过程,祖B细胞 前B细胞 不成熟B细胞 成熟B细胞 浆细胞 各个阶段的变化为Ig基因的重排和膜表面标志的变化,第三章 抗原(Antigen, Ag),内 容,第一节、抗原的基本概念第二节、抗原的免疫特征第三节、感染性抗原第四节、超抗原和免疫佐剂,抗原：一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性)，并能与相应的应答产物（抗体或效应细胞）在体内外发生特异性结合的物质(反应原性)。,第一节 抗原的基本特性,抗原的两种特性: 免疫原性 (Immunogenicity)-刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答的能力 免疫反应性 (Immunoreactivity)-与相应的应答产物在体内外发生特异性结合的能力,免疫应答：机体受抗原的刺激而诱发的免疫反应免疫反应：抗原与抗体相互作用的免疫反应,1、抗原的免疫原性和免疫反应性,其他概念：,完全抗原（complete Ag）：凡是有免疫原性和反应原性的物质.如大多数蛋白质细菌病毒等.半抗原不完全抗原（hapten）：只有免疫反应性没有免疫原性的物质.多为简单的小分子物质. 大多数多糖,类脂,某些小分子药物,食品中非蛋白质性功能因子等均属于半抗原.载体(carrier) :与半抗原结合后使其具有免疫原性的物质，即半抗原+载体完全抗原。 常用载体：BSA（牛血清蛋白） OVA（卵清蛋白） BGG（牛血清丙种球蛋白）,2、抗原的理化性质与分类,2.1 抗原理化性质1).分子的大小2).异源性: 识别自身和非自身.3).一定的化学组成与结构4).一定的物理状态5).抗原的完整性:抗原进入机体的方式和途径,2、抗原的分类,根据免疫原性来源与机体亲缘关系 诱导B细胞免疫应答中对T 的依赖性外源性抗原和内源性抗原,2.1 根据免疫原性,完全抗原不完全抗原,2.3免疫应答中对T细胞 的依赖性,胸腺依赖性抗原（TD-Ag）胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）,胸腺依赖性抗原（TD-Ag）,需有T细胞辅助决定簇种类多、排列无规律可引起体液免疫和细胞免疫可产生IgM、IgG型抗体（以IgG为主）有免疫记忆,胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）,不需有T细胞辅助决定簇数目多、排列有规律仅产生IgM型抗体不能引起细胞免疫无免疫记忆,内源性抗原（endogenous antigens）指细胞内产生的蛋白质抗原细胞产生的自身固有蛋白质胞内寄生病毒或其它病原体产生的蛋白质细胞恶性转化后产生的突变蛋白，即肿瘤抗原有核细胞内加工，由MHC分子递呈,2.4 外源性抗原和内源性抗原,Listeria,外源性抗原 (exogenous antigens)指由细胞外进入细胞的蛋白质抗原细胞摄入的各种病原体和疫苗在吞噬体和内体中生长的病原体摄入的自身蛋白抗原递呈细胞内加工，由MHC分子递呈,第二节 抗原的免疫特征,1. 抗原的特异性,抗原性的特异性：抗原只能与其相应的抗体或致敏淋巴细胞结合抗原的特异性表现在两个方面：免疫原性上 免疫反应性上抗原具有特异性的物质基础是什么？ -抗原决定簇,一 抗原的特异性和抗原决定簇,抗原决定簇（antigenic determinant,AD）: 又称表位（epitope），指抗原分子中决定抗原特异性的特殊的化学基团，是抗原分子 与抗体及TCR/BCR特异结合的部位，也是被免疫细胞识别的标志及免疫反应具有特异性的物质基础。 表位的性质、数目和空间构象决定了抗原的特异性 隐蔽性表位：存在于抗原分子内部的决定簇.,2. 抗原决定簇及其类别,2) 抗原决定簇的大小数目 蛋白质抗原决定簇: 5-6个氨基酸残基 多糖抗原决定簇: 5-7个葡糖糖残基 核酸半抗原决定簇: 6-8个核苷酸,3) 抗原决定簇的空间排列和立体构型构象决定簇：序列上不相连而依赖于蛋白质或多糖的空间构 象形成的决定簇，多暴露于抗原分子表面。主要由T识别，B也可识别顺序决定簇：一段相连的氨基酸序列所形成的决定簇，多位 于抗原分子 内部。由B识别,3. 抗原结合价：能和相应抗体结合的功 能性表位的数目。半抗原 单价 天然抗原 多价多价抗原可同时与多种/多个抗体结合。,二、半抗原的免疫特征,1. 半抗原的特点 只有与某种载体偶联才能表现出免疫原性。在偶联分子在红相当于一个抗原决定簇或者是一个免疫优势决定簇 大多数多糖,类脂,某些小分子药物,食品中非蛋白质性功能因子等均属于半抗原.2. 载体效应 :在免疫应答中，B细胞识别半抗原，并提呈载体表位给CD4阳性T细胞；Th细胞识别载体表位。通过载体把特异的T-B细胞之间连接起来，T细胞才能激活B细胞，使B细胞分泌抗体,三、抗原的交叉性 交叉反应：两种来源不同的抗原由于具有共同的抗原决定簇或相似抗原决定簇，由此决定簇刺激机体产生的抗体可与两种抗原结合发生反应。 共同抗原：具有共同抗原决定簇的两种抗原p45,第三节 感染性抗原,细菌病毒(自学),1. 细菌,3.1.1. 表面抗原,定义：包围在菌细胞壁外面的抗原分类： 夹膜抗原： Vi抗原：伤寒沙门菌的表面抗原化学成分为 糖 脂，不耐热，容易被石碳酸所破 坏 K抗原；大肠杆菌细胞壁外层，为多糖不耐热,3.1.2 鞭毛抗原和菌毛抗原 化学成分蛋白质，抗原性不强，不耐热，易被乙醇破 坏，与毒力无关,3.1.3 菌体抗原,存在于菌体的胞壁部分，较耐热，不易被乙醇破坏 特异性抗原-有些成分为某些细菌或某型细菌所持有 共同抗原-有些成分为数种细菌所共有,3.细菌毒素和类毒素抗原外毒素: 细菌产生毒素后可以游离于菌体之外的类毒素, 有高度的抗原性.类毒素: 细菌所产生的外毒素经甲醛(福尔马林)去除 毒性保留免疫性的制剂,3.细菌保护性抗原,概念：微生物具有多种抗原成分，但其中只有1-2种抗原成分能刺激机体产生抗体，从而对抗体起免疫保护的作用。这些抗原称为保护性抗原。炭疽杆菌和结核杆菌的培养液中产生的多种胞外成分，其中有些成分具有免疫原性,有保护动物抵抗毒菌攻击的能力炭疽的保护性抗原是一种可溶性蛋白,第四节 超抗原与免疫佐剂,一、超抗原（superantigen, SAg）1、概念：只需极低浓度（110ng/ml）即可激活220的某些亚型的T细胞克隆，产生极强的免疫应答。2、种类：外源性超抗原和内源性超抗原。前者如金黄色葡萄球菌肠毒素AE，后者如小鼠乳腺肿瘤病毒蛋白。3、与普通抗原的区别：1）极低浓度，极强应答2）不受MHC的限制3）不具备抗原识别的特异性，不需APC的加工和递呈4）引起诸多细胞因子的释放，导致严重病理性后果,二、佐剂（adjuvant）1、概念增强机体对抗原免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强剂2、种类生物性：如卡介苗无机化合物性：如氢氧化铝人工合成类：如胞苷酸，脂质体常用的佐剂有弗氏完全佐剂（CFA）和弗氏不完全佐剂（IFA）3、作用机制1）改变抗原物理性状，增加抗原在体内停留时间；2）刺激抗原提呈细胞，增加对抗原的处理和提呈能力；3）刺激淋巴细胞增殖分化，增强和扩大免疫应答的能力。,1. 食品中的功能因子与活性物质抗原,蛋白质性的活性物质：如钠豆激酶，具有抗栓功能，具有免疫原性非蛋白质性的活性物质：异黄酮类物质，半抗原,三、 食品中的抗原物质,2. 食品中的抗生素，农药，激素，兽药抗原,通称为残留物.多数为非蛋白类物质,也是一种半抗原,3、脂多糖：细胞壁的主要成分专一性和一类细胞表面的受体结合，通过胞内信号进行传递，激活,第四章 抗体（Ab）,第一节 抗体结构与功能,一、基本概念二、抗体的分子结构三、抗体的特点与功能四、抗体的生物学活性五、抗体的免疫原性,抗体（antibody,Ab)是B细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白,一、基本概念：,抗体和免疫球蛋白的关系: 抗体都是免疫球蛋白，并非所有免疫球蛋白都具有抗体活性。分泌型Ig(存在于体液中）和膜型Ig(存在于B淋巴细胞膜上的抗原受体),二、抗体的分子结构,（一）抗体的基本结构,四肽链结构 ，链间二硫键连接两条重链（H）和两条轻链（L）氨基端和羧基端。,(1)根据重链分类： 根据重链靠近羧基末端氨基酸组成及排列顺序不同，将重链分为种：、 根据重链组成不同，将Ig分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE(2)根据轻链分型：、型 天然Ig分子中，重链同类，轻链同型,1.重链与轻链,根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C）可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较大 -抗体与抗原特异性结合的分子基础恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及 含糖量都比较稳定 -抗体如何发挥作用的主要区域,2.可变区与恒定区,超变区（ HVR）-V区域内氨基酸组成与排列顺序的变化最为剧烈的区域轻链：24-34、50-56、89-97重链：31-35、50-65、95-102,超变区又称为决定簇互补区（CDR） Ig的抗原结合部位,位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。,3. 铰链区,4.J链和分泌片,J链是一条多肽链，富含半胱氨酸，由浆细胞合成，以二硫键的形式共价结合到Ig的重链上-稳定多聚体结构及参与体内运转的作用分泌片：由黏膜上皮细胞合成和分泌，以非共价形式结合到二聚体上，保护IgA，使之不受环境中酶的破坏，并介导IgA的转运,（二）抗体的水解片段,木瓜蛋白酶(papain)水解IgG：得到两个相同的Fab段和一个Fc段。,（二）免疫球蛋白的水解片段,胃蛋白酶(pepsin)裂解IgG：得到一个具有双价活性的F（ab）2段和若干个小分子多肽碎片（pFc）,（三）抗体的功能区,Ig的H链、L链每隔110个氨基酸即由链内二硫键连接形成一个能行使特定功能的球性单位，称为Ig的结构域或功能区（domain）。,VH和VL:识别和结合抗原CH和CL:同种异型的遗传标志CH2:补体C1q结合位点，IgG可通过胎盘CH3/CH4:与多种细胞表面的FcR结合(免疫调理,I型超敏反应),各功能区的作用,IgG多为单体，是唯一能通过胎盘的抗体据重链（链）免疫原性，IgG分4个亚型,（一）IgG,三、五类抗体的特性与功能,IgG1、IgG2和IgG3能通过经典途径激活补体血清含量最高(75%85%),也是丙种球蛋白的主要成分半衰期较长（1624d）主要的抗感染抗体(具有抗菌、抗病毒、中和毒素和免疫调理作用)参与II、III型超敏反应,IgG的特点,为五聚体，是分子量最大的Ig，称巨球蛋白。IgM激活补体、结合抗原、免疫调理作用比IgG强天然血型抗体是IgM,（二）IgM,1.IgM是个体发育中最早产生的抗体，胚胎 晚期已能合成，新生儿脐带血中若IgM 水平升高，提示胎儿曾有宫内感染2. IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，半衰期 短，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断3. mIgM是B细胞抗原受体（BCR）的主要成分 也可参与II、III型超敏反应,IgM的特点,分为血清型和分泌型两种。血清型IgA主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生，为单体。而分泌型IgA（sIgA）是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生，为双体、三体或多体。sIgA主要存在于唾液、泪液、以及呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。,(三)IgA,IgA的特点,参与皮肤粘膜的局部抗感染作用初乳中含有高浓度的sIgA-母乳喂养通过替代途径激活补体参与型超敏反应,sIgA的合成和主要作用部位在黏膜,1.IgD是B细胞的重要表面标志2.B细胞的分化过程中首先出现mIgM， mIgD的出现标志着B细胞成熟3.对防止免疫耐受有一定作用,(四)IgD,1.血清中含量最低2.可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高 亲和力Fc受体（FcR）结合， 引起型超敏反应3. FcR分布于巨噬细胞、B细胞、嗜 酸粒细胞,(五)IgE,四、抗体的生物学活性,V区的功能: 识别和结合特异性抗原C区的功能： 激活补体:IgM,IgG1-3;IgG4,IgA,IgE 结合细胞表面的Fc受体发挥调理作用、 ADCC作用、介导I型超敏反应 穿过胎盘和黏膜选择性传递,五、抗体的免疫原性,免疫球蛋白的不同结构区其免疫原性不同：同种型（isotype）： 种属特异性标志同种异型（allotype）：个体特异性标志独特型（idiotope）： 免疫调节网络,同种型(isotype):同一物种内所有个体共同具有的Ig抗原特异性结构,同种型Ig的抗原决定簇存在于CH、CL据CH的不同，Ig分类、亚类据CL的不同，Ig分型、亚型,同种异型（allotype)：同一物种内不同个体间的Ig免疫原性的差别位于CH、CL特定部位的某个或某个氨基酸的不同,独特型（idotype)：同一个体内不同B细胞克隆产生的Ig其超变区各自具备独特的抗原决定簇结构,第十章 抗原和抗体的制备与应用,第一节 天然抗原的制备第二节 人工抗原的制备第三节 多克隆抗体的制备第四节 抗体的纯化和鉴定第五节 单克隆抗体的制备与抗体的应用,第一节 天然抗原的制备,一、颗粒天然抗原的制备二、可溶性抗原的分离与纯化,1.细菌抗原(多用液体或固体培养物集菌后处理) H抗原: 用有毒力的菌株，菌液用0.30.5 甲醛处理 O抗原: 需要100加温22.5h后应用。 Vi抗原; 应在杀菌后再加0.51氯化钙溶液。 有些细胞膜成分，如组织细胞膜、血细胞膜经打碎后亦可制成颗粒抗原。颗粒抗原悬液呈乳浊状，多采用静脉内免疫法，较少使用佐剂作皮内注射。,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养 3724h,100水浴 22.5h 杀菌,无菌试验,NS稀释成810亿/ml,O菌体抗原,返回,菌体抗原的制备,菌苗: 用细菌体制成的生物制品1）活菌苗:预防结核病的卡介苗、鼠疫活菌苗等。关键: 获得减毒或无毒菌株，但应保持免疫原性。优点; 一般只需接种一次，且需量较小，但引起的 免疫效果好，能维持较长时间。缺点: 活菌苗需维持其活力，菌苗的保存需一定的冷藏条 件，且有效期短。,2）死菌苗,死菌苗：用化学或物理方法将病原菌杀死后仍保持免 疫原性可制备死菌苗。常用的死菌苗：霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙混合菌苗、 百日咳菌苗等。 特点: 病原菌已被杀死，不能繁殖，用量较大，接种 后可能出现局部肿痛或发热等全身反应; 大 多需多次接种。,2. 血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备1） 绵羊红细胞的制备2）组织和细胞粗抗原的制备,绵羊红细胞的制备流程图,摇动15-20min,4,可保存3周,取适量,NS洗涤3次2000r/min 10min,NS稀释至 25%,2）组织和细胞粗抗原的制备 处理好的组织用生理盐水洗去血迹及污染物。将洗净的组织剪成小块，进行粉碎。 组织匀浆通过20003000r/min离心10min后分成两个部分 沉淀物含有大量的组织细胞和碎片； 上清液作为提取可溶性抗原的材料，提取前还要通过10002000r/min2030min的高速离心，以除去微小的细胞碎片，此时上清液应澄清,来源: 组织和细胞，其成分比较复杂 1.组织和细胞成分混合抗原制备 2.蛋白质抗原制备 3.核酸抗原制备 4.类脂多糖抗原制备 5.免疫球蛋白片段制备 6.纯化抗原的鉴定,二、可溶性抗原制备及鉴定,可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸,二、可溶性抗原制备及鉴定,返回,1.组织和细胞成分混合抗原制备程序,上清液澄清,所用材料必须是新鲜或低温保存的,去除包膜或结缔组织,脏器进行灌洗,洗去血迹及污物,NS内含0.5gL NaN2,冷浴中组织剪碎,装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液,3000rmin10min,取上清液,去除细胞碎片及微小组织,离心,细胞破碎技术及评价,1).酶处理法2).冻融法3).超声破碎法4).表面活性剂处理,细胞破碎技术及评价,蛋白质抗原制备,蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高 的抗血清通常需要纯化。可采用： 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法,2.蛋白质抗原制备,核酸抗原制备,大分子的核酸具有免疫原性。提取核酸的主要步骤：,3.核酸抗原制备,破碎细胞,核酸从细胞中游离出来,酸沉淀核,除去蛋白质,乙醇,酚和氯仿,类脂多糖抗原制备,苯酚法提取LPS：,干燥菌体或湿菌体,水中混匀,激烈搅匀加热5min,冰水急冷,降至10以下,离心,上层的水层(含LPS)下层的酚层菌体残渣于底部,吸取水层,透析除酚,加热,超速离心,浓缩,LPS 在上层沉淀的透明胶状部内,绞出,悬于水中,离心,得纯化LPS,4.类脂多糖抗原制备,同温的苯酚,免疫球蛋白片段制备,1酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。,5.免疫球蛋白片段制备,2氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。,3. 还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋 白亚单位分开。,酶水解免疫球蛋白示意图,Fc段，用以制备抗重链血清,F(ab)2，常作为抗体试剂用于试验,木瓜蛋白酶（papain),胰蛋白酶(pepsin),胃蛋白酶(pepsin),1. 氧化法：优点是切开后，肽链不能重新 形成二硫键、便于肽链纯化； 缺点是色氨酸侧链容易被破坏。,氧化法和还原法评价,返回,2. 还原法：将二硫键还原成琉基。但极不 稳定，易重新形成二硫键，必须及时用 碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化。,纯化抗原的鉴定,1.含量鉴定 2.理化性质鉴定 凝胶层析技术测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳 超速离心3.纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验,6.纯化抗原的鉴定,蓝色,1含量鉴定,在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关。,方法：酚试剂法鉴定主要试剂：磷钼酸-钨酸的混合酸原理：,蛋白质中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能,钨酸、钼酸,还原,3H2OP20513WO35MoO310H20和3H2P20514WO34MoO310H20,络合物的双缩脲法,蛋白质铜,碱性,加深,含量鉴定,蓝色,理化性质鉴定,已知分子量的标准品,测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。,凝胶柱,保留体积,分子量的对数,2.理化性质鉴定,绘制标准曲线,凝胶层析技术进行测定（视频）,垂直电泳,聚合成大分子凝胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE电泳视频）,有分子筛效应、电荷效应及浓缩效应，能精 确地分离和鉴定高分子物质。,PAG的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量。 原理：,双丙烯酰胺N,N-methylene bisacrylamide,Bis,丙烯酰胺(acrylamide,Acr),催化剂,3. 纯度鉴定,方法：醋酸纤维膜电泳进行鉴定。,返回,纯度鉴定,原理：蛋白质在一定pH下都带有电荷，由于 各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此 所带电量也各不相同，在外加直流电场的作 用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后 即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白 质抗原的纯度。,特点：快速简便。,三、半抗原免疫原的制备,1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、 某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。,第二节、人工抗原的制备,2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物,3.半抗原-载体连接方法:,载体类型,1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。,载体类型,2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)， 这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。,3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。,半抗原-载体连接方法1,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌12h,室温24h,透析除去未反应的半抗原,人工免疫原,半抗原载体连接方法1,混合,混合,半抗原-载体连接方法2,戊二醛法:,半抗原-NH2,载体蛋白-NH2,半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白,OHC-(CH2)3-CHO,*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂,半抗原载体连接方法2,半抗原-载体连接方法3,氯甲酸异丁脂法：,半抗原-COOH,载体蛋白-NH2,Cl-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-CO-NH-载体蛋白,半抗原载体连接方法3,简便，用于类固醇抗原制备,HO-CH2CH(CH3)2,半抗原-载体连接方法4,琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备,半抗原-CH2OH,CH2-CO CH2-CO,带羧基的半抗原琥珀酸衍生物,半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH,返回,吡啶,再经氯甲酸异丁脂法或碳化二亚胺法制备载体半抗原,半抗原载体连接方法4,第三节 多克隆抗体的制备,1.概念2.多克隆抗体的特点3.多克隆抗体的制备流程,一、 概念1.克隆：无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞分裂繁殖而形 成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。2.多克隆抗体:用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。3.单克隆抗体:由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高,少或无交叉反应性。,二 、多克隆抗体的特点,特点: 不均一性 (抗体的异质性), 由外源性和内源 性因素引起的1) 外源性: 抗原分子结构复杂, 具有多种抗原 决 定簇, 每种决定簇引起一种相应抗体的 产生. 反映了机体对抗原物质的精细结 构的识别能力. 2) 内源性: 免疫球蛋白的血清型(回顾),免疫蛋白为大分子蛋白质，具备抗原的各种性质，对异种、同种异体，甚至宿主自身都是良好的抗原，且是一个抗原复合体，带有多种抗原决定簇。Ig分子的这种异质性反映了抗体形成细胞的遗传性差异，代表抗体分子在不同水平上的遗传变异性；通常可用血清学方法检测出来，并据此将Ig及其肽链（H和L链）分成不同的血清学类型。 同种型 同种异型 独特型,免疫球蛋白的血清型:,三、多克隆抗体的制备流程,1.免疫动物的选择2.免疫的方法3.动物采血法4.免疫血清的分离与保存,一、免疫动物选择,能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。,一、免疫动物选择,1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；,2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎要求；,3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫 应答；,4.按需要量选择大小不同的动物。,二、免疫方法,4.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月 抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉,二、免疫方法,1.免疫原的注射剂量,2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌 3. 免疫时间间隔：首次和第二次之间10-20天为宜，第二次以后 7-10天。免疫次数3-5次。,三、动物采血法,1.颈动脉放血法：最常用的方法-常用于家兔的全采血 2.心脏采血法：要求操作熟练-常用于家兔和豚鼠的采血。 3.静脉采血法：颈静脉采血常用于绵羊；耳静脉采血常用于 家兔；尾静脉采血常用于小白鼠和大白鼠。,1.4保存：可保存36个月2.低温保存：-20-40，可保存23年3.冰冻干燥保存：可保存35年,三、动物采血法,四、免疫血清的分离和保存,第四节 抗体的纯化和鉴定,1.抗体特异性的纯化2.特异性IgG类抗体的纯化3.特异性抗体的鉴定,一、抗体特异性的纯化,1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。,一、抗体特异性的纯化,2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。,二、特异性IgG类抗体的纯化,1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取球蛋白 3次，基本为IgG类抗体，但不纯。,二、特异性IgG类抗体的纯化,2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个 IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。,3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等,三、特异性抗体的鉴定,1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定,三、特异性抗体的鉴定,2.抗体特异性鉴定： 细菌类抗原的抗体用凝集试验 可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验,3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法,4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好,1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定 效价：在给定条件下，抗血清经过一系列浓度的稀释后与定量的抗原反应，以能检测出抗血清最大稀释倍数即为该抗血清的效价。,4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好 抗体的亲和力（affinity）是指抗原与抗体结合的牢固程度。亲和力越大表示抗体的结合反应越快，抗原抗体复合物越不易解离。亲和力的大小是由分子的大小、抗体结合的位点、以及抗原决定簇之间的立体构型的适合程度决定的,第五节 单克隆抗体的制备及抗体应用,1、单克隆抗体的 特点特异性强高度的均一性和重复性效价高可无限供应具有单一的生物学功能对环境敏感,2、 单克隆抗体制备技术1) 核心: 用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology ）。,Niels K. Jerne,G. Kohler,C. Milstein,2) 杂交瘤技术的基本原理,3) 杂交瘤细胞的制备(自学）,（1）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基,骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 选择丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶( HGPRT）的骨髓瘤细胞: HGPRT-骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1: 优点: 既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子,单克隆抗体和多克隆抗体的比较,第十一章 抗原抗体反应与非标记免疫反应分析,抗原抗体反应定义: 抗原与相应抗体之间发生的特异性结合反应。可发生于体内，也可发生于体外,体内反应: 介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等； 体外反应: 根据抗原的物理性状、抗体的类型及参 与反应的介质（例如电解质、补体、固 相载体等）不同，可出现凝集反应、沉 淀反应、补体参与的反应及中和反应等,第一节 抗原抗体反应的原理,一、抗原抗体反应的原理,特异性结合机理: 基于两种分子间的结构互补性与亲和性2. 抗原抗体反应分为两个阶段: 第一: 抗原与抗体发生特异性结合的阶段 第二: 可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素的影响 下，进一步 交 联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、 补体结合介导的生物 现象等肉眼可见的反应。,电解质、pH、温度、补体,（一）亲水胶体转化为疏水胶体,1. 亲水胶体的形成机制: 因蛋白质含有大量 的氨基和羧基 残基，这些残基在溶液中带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云。 2. 疏水胶体如何形成: 抗原抗体的结合会使电荷减少或消 失，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。,电荷引力范登华引力氢键结合力疏水作用,（二）抗原抗体结合力,1. 电荷引力（库伦引力或静电引力）: 抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力. 例如，一方在赖氨酸离解层带有阳离子化的氨基残基（-NH3 + ），另一方在天门冬氨酸电离后带有阴离子化的羧基（-COO- ）时，即可产生静电引力，两者相互吸引，可促进结合。这种引力和两个电荷间的距离的平方成反比。两个电荷越接近，静电引力越强。反之，这种引力便很微弱。,2.范登华引力: 原子与原子、分子与分子互相接近时发生的一种吸引力，实际上也是电荷引起的引力。 由于抗原与抗体两个不同的大分子外层轨道上电子之间相互作用，使得两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力，促使抗原抗体相互结合。这种引力的能量小于静电引力。,3.氢键结合力: 氢键是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。当具有亲水基团（例如-OH,-NH2 及 -COOH）的抗体与相对应的抗原彼此接近时，可形成氢键桥梁，使抗原与抗体相互结合。氢键结合力较范登华引力强，并更具有特异性，因它需要有供氢体和受氢体才能实现氢键结合。,4.疏水作用: 抗原抗体分子侧链上的非极性氨基酸（如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸）在水溶液中与水分子间不形成氢键。当抗原表位与抗体结合点靠近时，相互间正、负极性消失，由于静电引力形成的亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，从而促进抗原与抗体间的相互吸引而结合。这种疏水结合力对于抗原抗体的结合是很重要的，提供的作用力最大。,按大小排序：,疏水作用 氢键结合力 电荷引力范登华引力,二、抗原抗体反应的特点,特异性按比例可逆性,（一）特异性,1. 结合实质: 抗原表位与抗体超变区中抗原结合点 之间的结合。 这种特异性如同钥匙和锁的关系。例如白喉抗毒素只能与相应的外毒素相结合，而不能与破伤风外毒素结合。例外; 交叉反应出现,（二）按比例,存在最适合比例 在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。 以沉淀反应为例，若向一排试管中加入一定量的抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶性抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线。,一些重要概念,抗原抗体反应的等价带: 曲线的高峰部分是抗原抗体分子 比例合适的范围最适比: 抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多。其中有 一管反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎