脑缺血动物模型与抗脑缺血

脑缺血动物模型,脑缺血动物模型,动物模型是医学药学研究中的一个重要手段，尤其对于缺血性脑血管病，能即刻制造或模拟血流下降或阻断，只有利用动物模型才能进行。动物模型具有方便、快捷、条件可控、脑缺血程度一致等优点。近年来，脑缺血的研究进展有利于各种动物模型的广泛应用。,建立和选择理想的缺血性脑损伤动物模型，对于缺血性脑血管病研究具有重要意义。脑缺血动物模型对以下研究具有很重要的实际应用价值: (1)不同脑缺血状态下的病理学改变；(2)缺血半暗带的研究；(3)再灌注损伤；(4)缺血本身导致的病理生理学变化；(5)干预治疗对缺血性损害的保护作用；(6)缺血性损害的部分机制等。,脑缺血动物模型的分类,各种动物模型具有不同的特点，因此应根据不同的研究目的选择最适宜的动物模型。根据动物种类分类：可分为猴、狗、大鼠、小鼠等脑缺血模型。其中啮齿类动物因价格便宜、来源充足、制作模型方法简单、存活率高、脑血管解剖和生理特点与人接近，被广泛用作脑缺血及缺血再灌注模型；根据缺血范围分类：又可分为全脑缺血和局灶性缺血两种。现将常见的脑缺血动物模型概述如下：,一、全脑缺血模型(Global cerebral ischemia models),全脑缺血模型是完全阻断或骤然降低大脑的血流，造成全脑缺血。近年来利用啮齿类动物复制全脑缺血模型，在缺血性脑损伤的研究中较为广泛。共同特点：缺血暂时广泛地影响各个脑区，但病理改变发生在易损区。,大鼠四血管阻断模型The Four-Vessel Occlusion (4VO) Model in the Rat,大鼠四脑动脉阻塞模型：双侧椎动脉和双侧颈总动脉阻断。用3水合氯醛麻醉（300mg/kg,ip.）。然后于枕骨下作1cm左右切口，暴露第一颈椎左右两个横突孔，以1411高频小电刀插入横突孔烫闭双侧椎动脉。24h后乙醚麻醉状态下切开颅顶皮肤，于矢状缝与冠状缝相交及颞骨与人字缝相交处分别埋植脑电极，接于SJ-42多导生理记录仪，以在实验过程中记录大鼠的脑电图（EEG）及翻正反射恢复时间。,将大鼠仰卧位固定，分离双侧颈总动脉。大鼠清醒状态下用小动脉夹夹闭双侧颈总动脉，可见大鼠意识和翻正反射消失，眼变白，竖毛，呼吸加快。30min后去除动脉夹，造成再灌注模型。再灌同时股静脉注射60mg/kg伊文思蓝。60min后大鼠断头取脑，然后用生理盐水和丙酮混合液（3：7v/v）制成10%匀浆（W/V）。离心，取上清液，在620nm处测吸光度表示脑组织中伊文思蓝含量，以此反映受试药对脑血管通透性的影响。,优点：可产生严重的脑缺血。可较好地模拟临床上多种原因造成的全脑缺血性损伤过程；缺血一定时间后可按实验要求重新开启动脉夹进行再灌注。缺点：成功率低，约50%；操作相对复杂、不能一次完成，动物的死亡率高。 该方法适合于脑缺血的急性实验研究，现仍被广泛应用。,二、局灶性脑缺血动物模型(Focal cerebral ischemia models),由于大脑中动脉（middle cerebral artery， MCA）是脑卒中的多发部位，因此大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO) 模型被认为是一种较理想的动物模型。阻断MCA 的方法主要有开颅法、线栓法以及栓塞法。最常用的是线栓法,线栓法(thread embolism method),线栓法：是目前国内外学者制备MCAO动物模型最常用的方法。该方法是Koizumi于1986年发明的。在1989年，Longa对这种方法加以改进，而后广泛用于实验性脑缺血研究。目前在脑缺血实验中多采用Longa改进的线栓法。,1、线栓的制备,在制备大鼠MCAO模型的过程中，线栓的制备颇为重要。将线分别截成50mm左右线栓，在前20mm用记号笔抹上颜色以作进入颅内血管深度的标记，并将线栓制备好后置肝素生理盐水中备用。线栓的制备主要有两种方法：Koizumi 将栓线的前段5mm 左右的部分涂上硅树脂，使其变粗，变硬，直径达0.250.3 mm，以利于进线和阻断血流；Longa 法是将栓线的头端烧成小的圆头，直径稍大于线栓的直径。,2、线栓的插入,颈外动脉切口插入法：此种方法可以用来制备脑缺血、脑缺血再灌注模型。由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用。然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。,将尼龙线经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进18mm 左右时感到阻力，即到达了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA 的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。在一定时间后拔出尼龙线，扎紧动脉残端，即可实现MCAO导致局灶性脑缺血-再灌模型。,图1 大鼠颅底内外血管（部分）模式图,3、线栓法制备动物模型的影响因素,栓线法大鼠MCAO模型在国际上已被广泛采用。但仍有很多因素可影响该模型缺血程度的稳定，如动物体重、栓线的直径及插入深度、肝素的使用等，会遇到有的动物无脑缺血症状或症状很轻，有的动物症状很重或死亡。因此，必须充分考虑建立模型过程中的影响因素。,（1）线栓的选择线栓的选择直接关系着造模的成功与否。一般选择为外科尼龙线，直径有3-0、4-0 两种。但许多学者在实验中发现，运用0.200.26 mm 的进口鱼线代替4-0 外科手术线，由于其韧性好，硬度也较佳，进线时较4-0 手术线顺利，有利于模型的制备，且较经济。,由于直径和线质量硬度的不同而导致梗塞灶部位和体积的变化。一般来说，选择标准是不能太硬，这样很容易刺破血管造成蛛网膜下腔出血；也不能太软，当线栓进入大脑前动脉时能感到阻力，也就是再插线会见到线弯曲，太软则弯曲不明显。在选择使用鱼线时，最好用细砂纸打磨头端，并将头端沾蜡5mm左右，造模成功率较高。,（2）线栓插入深度线栓插入的深度是模型成功的关键环节。插入过深会剌破颅内动脉造成蛛网膜下腔出血；过浅则达不到阻塞MCA的位置。很多报道指出深度与动物的体重等情况相关。目前对于线栓进入深度较为统一的意见是从颈外动脉起始处计18.50.5mm。如果线栓进入的长度明显小于17mm 时，则会导致造模失败，影响实验结果和可靠性。,（3）动物体重文献报道大鼠体重指标为250-330g。要确保所使用线栓能够阻塞实验动物的MCA ；手术前应禁食过夜，避免大鼠血糖不稳定；麻醉剂用量对手术的影响。,五、缺血性脑损伤的评价方法,在局灶性脑缺血动物模型中，常用的评价缺血损伤的方法有以下几种。（一）形态学评价1、光镜观察将脑组织染色后放在光学显微镜下观察，可以看到脑缺血后神经元肿胀、轮廓不清、空泡样变性及核固缩等一系列病理形态学变化， 从而对缺血损害做出评价。,2、电镜观察,电镜下可看到缺血神经元线粒体肿胀，嵴崩解，内质网池扩张变形，粗面内质网脱颗粒等结构改变。,3、TTC染色,采用氯化三苯基四氮唑( triphenyltetrazolium chloride，TTC) 对脑组织染色，其原理是TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的triphenylformazan（TTF），用来表示细胞的活力。结合图像分析技术观测梗塞范围。通过测量梗塞体积来衡量脑缺血的严重程度。是评价脑缺血损伤常用的指标。,TTC染色的方法：,大鼠迅速断头、取脑，-20冷冻约15 min 。待其稍变硬时，从冰箱取出，用切片机将两侧大脑半球切成厚1.5 mm的冠状切片，浸泡于10 ml 1%的TTC磷酸缓冲液中。37避光孵育约15 min，此间将脑片的上下面翻转至少一次，以便两面染色一致。正常脑组织染为深红色，脑梗死区不染色（灰白色）。,图2 TTC染色：正常脑组织为深红色，梗死区为灰白色,（二）神经机能学评价,1、行为学评价多采用Longa评分。Longa 的神经功能缺损5分制标准为：0分：无神经系统功能缺损症状，活动正常；1分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁（图3）；2分：爬行时出现向非手术侧转圈（追尾现象）；3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。,图3 Longa神经行为评分（1分）,2、脑电图观察,局灶性脑缺血会引起脑电波的抑制，缺血区脑电图出现波幅降低，频率减慢.,五、实验性脑缺血损伤的影响因素,多数麻醉药可影响动物的呼吸，引起高碳酸血症，酸中毒，并可降低血压，对缺血性脑损伤程度有直接影响，因此，麻醉药的种类、剂量、给药途径等因素均影响模型的制备。国内实验多采用腹腔注射麻醉。常用的麻醉药中，苯巴比妥钠对体温和呼吸的影响最大，水合氯醛和乌拉坦次之，戊巴比妥钠相对较小。此外，氯胺酮和甲苯噻嗪腹腔注射麻醉也会对动物的呼吸、心率等造成明显影响。,水合氯醛以其体内代谢产物三氯乙醇发挥麻醉作用，对呼吸抑制作用较其它中枢麻醉药小，大剂量可引起呼吸和心血管系统抑制，引起血压降低和酸中毒。其镇痛作用较弱。实验中多采用3%水合氯醛(300mg/kg)进行麻醉。,（二）脑温,实验中温度过高或过低均会影响神经细胞损伤。脑温下降23对缺血性脑损伤，尤其皮质损伤具有明显的保护作用。亚低温均可抑制脑缺血损伤. 在缺血期低温必须持续1 2 h才能起到保护作用，持续时间30min则无效。,亚低温保护脑的可能机制：降低脑耗氧量和能量代谢、减少乳酸堆积;减轻炎性因子的损害;保护血脑屏障;减轻脑水肿及降低颅内压等。 因此，实验中应严格控制动物脑实质的温度。,（三）血糖,葡萄糖水平可影响脑损伤程度.高血糖缺血后的脑梗死体积 缺血性损伤 。其机制可能与糖酵解增加，乳酸堆积引起酸中毒有关。葡萄糖通过酵解可产生2分子丙酮酸，同时产生2分子ATP。在有氧条件下，丙酮酸会在丙酮酸脱氢酶作用下，进行代谢，并在线粒体内经一系列反应产生CO2和36分子ATP；,但在缺血缺氧时，丙酮酸脱氢酶活性受抑制，此时丙酮酸则在乳酸脱氢酶作用下产生乳酸，局部脑组织PH下降。因此，当葡萄糖由有氧氧化转化为无氧酵解时，不但使能量产生减少，还可引起脑组织局部环境酸度增加。脑缺血后，由于脑血流的减少，葡萄糖供应的减少可能会限制乳酸的产生量。如果此时增加葡萄糖的血浆浓度，大量糖就会通过酵解产生乳酸，从而加重酸中毒。因此控制血糖水平对模型的损伤程度也非常重要。可在模型制作之前，动物统一禁食12h。,（四）血压和血气,血压对脑梗死模型有一定影响，高血压的动物缺血改变出现早，而全身低血压也会加重脑损伤，因此，实验应常规监测平均动脉压。脑缺血时，血气对损伤程度也有较大影响，高碳酸血症和酸中毒明显增加脑梗死