免疫组化技术.ppt

第六讲免疫荧光组化技术 主要内容一 荧光的特征二 荧光素三 荧光素标记抗体的方法四 荧光抗体的质量鉴定五 免疫荧光组化染色方法六 荧光显微镜七 非特异性荧光的消除方法八 激光扫描共聚焦显微镜 思考题 1 什么叫荧光 2 常用荧光素有哪些特征 3 标记荧光抗体有哪二种主要的制备方法 4 免疫荧光组化直接法 间接法的原理和主要操作流程 5 观察荧光组化片时应注意哪些问题 6 非特异性荧光的消除方法有哪几种 一 荧光的特征分子都含有电子 电子在不停地运动着 根据量子理论 运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中 电子遵守一定的规则 要以从一个能级向另一能级跃迁 并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放 激发当电子吸收能量跃迁到较高能级 这个过程叫激发 发射以辐身方式跃迁时 能量转化成相应波长的光 这个过程叫发射 荧光跃迁到激发态的电子 大多处于单重激发态 如果电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态 由于单重激发态很不稳定 半衰期很短 发射持续的时间也很短 这种发射光 叫荧光 二 荧光素能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素 必须具备 吸收激发光的光能并发射荧光 1 具备用于标记抗体的荧光素条件 1 应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团 结合后不易离解 而未结合的色素及其降解产物易排除 2 荧光效率高 与蛋白质结合后荧光素质量下降不多 3 标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响 4 结合方法简便而快速 并且较稳定 5 荧光素容易溶解 溶解后不会和其他物质发生化学反应 6 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明 能清晰判断结果 2 荧光素的种类 1 异硫氰酸荧光黄 FITC 分子量390D 最大吸收光谱为490 495nm 最大发射光谱为520 530nm 呈现明亮的黄绿色荧光 分子量389 4 2 四甲基异硫氰酸罗达明 TRITC 是罗达明的衍生物 易溶于水 最大吸收光谱为550nm 最大发射光谱为620nm 呈橙红色荧光 3 四乙基罗达明 RB200 呈褐红色粉末状 溶于乙醇和丙酮 性质稳定 可长期保存 最大吸收光谱570nm 最大发射光谱596 600nm 呈明亮橙红色荧光 分子量580 RB200不能直接和蛋白质结合 要先经五氯化磷反应 转化成硫酰氯 再与蛋白质的氨基结合 4 1 二甲基氨基 5 硫酰氯 5 4 乙酰胺 4 异硫氰酸 2 硫酸芪 SITS 6 得克萨斯红 Texasred 7 藻红蛋白 PE 8 花青 Cyanine Cy2 Cy3 Cy5 三 荧光素标记抗体的方法 一 FITC标记抗体的方法1 Marsshall法 1 原理 当FITC在碱性溶液中与抗体反应时 主要是抗体分子上的赖氨酸 氨基与FITC上硫碳胺键结合 一个IgG分子中有86个赖氨酸残基 一般最多能结合15 20个 荧光素FITC N C N 蛋白质 SHHFITC N C N 蛋白质 HSH 2 操作流程抗体与荧光素比例为50 100 1抗体的准备 20mg ml 碳酸盐缓冲液为总量的1 10 荧光素的准备 用分析天平准确称取0 01mgFITC 1mg抗体 结合 边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中 透析过柱Sephade G50或G25保存4 40 等量甘油分装保存 2 Chadwick法3 改良法4 透析标记法 二 四乙基罗达明标记抗体方法 三 藻红蛋白标记抗体方法 四 荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定 1 特异性染色效价测定2 非特异性染色测定3 吸收试验4 F P比值的测定方法 五 免疫荧光组织化学染色方法1 直接法简便 快速 用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合 操作流程 1 冰冻切片经固定 凉干PBS洗 石蜡切片脱蜡至水 消化30min PBS洗 2 适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上 湿盒内37 温育1h PBS洗3 3min 3 0 01 伊文氏蓝衬染1 3min PBS洗3 3min 蒸馏水洗2次 除去Nacl结晶 4 pH9 0缓冲甘油封片 5 镜检 2 间接法是直接的重要改进 先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合 随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合 操作流程 1 冰冻切片经固定 凉干后PBS洗 石蜡切片脱蜡至水 PBS洗 酶消化 PBS洗3 3min 2 适当稀释特异性一抗 37 孵育1h 或室温4h 或4 过夜 PBS洗3 3min 3 荧光标记二抗适当稀释37 30min PBS洗3 3min 4 0 01 伊文氏蓝衬染1 3min PBS洗3 3min 5 封片 镜检 六 荧光显微镜检查方法1 荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具 它是由超高压光源 滤片系统 包括激发和压制滤板 光学系统和摄影系统等主要部件组成 是利用一定波长的光激发标本发射荧光 1 光源光源的亮度应根据荧光素的类型选择 小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求 对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯 其工作时 两个电极间放电 引起球内水银蒸发 经过5 15min 球内气压升至50 70标准大气压 此时达到最高亮度 成为稳定工作状态 2 滤片系统是荧光显微镜的重要组成部分 是获得特定波长光 清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键 了解滤片性能 正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件 滤片系统包括激发滤片 阻断滤片 隔热滤片 分光镜和其他一些中性滤片 荧光显微镜的滤片系统 2 标本制作要求 1 载玻片厚度应在0 6 1 2mm之间 2 盖玻片应光洁 厚度在0 17mm左右 3 标本不能太厚 如太厚激发光大部分消耗在标本下部 而物镜直接观察到的上部不能充分激分 4 封片剂常用甘油 必须无自发荧光 无色透明 荧光的亮度在pH8 5 9 5时较亮 不易很快褪去 甘油和0 5mol LpH9 0 9 5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂 荧光信号增强封片剂mowiol40 884 8g甘油12ml蒸馏水12ml0 2mol LTris pH8 5 24ml 上述混合 加热溶解 5000g离心 15min 最后加入1 4 diazobicydo 2 2 2 octane DABcos 终浓度2 5 约1 25g 溶解后 分装存于 20 中 5 镜油 3 使用荧光显微镜注意事项 1 严格按说明书操作 不要随意改变程序 2 应在暗室中进行检查 3 防止紫外线对眼睛的损害 在调整光源时应戴上防护眼镜 4 检查时间每次以1 2h为宜 超过90min 超高压汞灯强度逐渐下降 荧光减弱 5 荧光显微镜光源寿命有限 标本应集中检查 以节省时间 保护光源 光源关闭后必须在30min后才能再启动光源 一天中应避免数次点燃光源 6 标本染色后应立即观察 7 荧光高度的判断标准 分四级 为阴性 为仅能见明确可见的荧光 为可见有明亮的荧光 为可见耀眼的荧光 七 非特异性染色的消除方法根据产生的原因采取适当的方法 常用方法 1 动物脏器粉末吸收法2 透析法3 SephadexG 50柱层析法4 DEAE纤维素柱层析法5 荧光抗体稀释法6 纯化抗原方法7 纯化抗体方法8 伊文氏蓝衬染方法 0 01 伊文氏蓝 八 激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜 laserscanningconfocalmicroscope LSCM 是80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品 实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像 从而对被检物体样品从停留到表面单层 静态平面的观察进行到立体 断层扫描 动态全面的观察 在生命科学研究中得到迅速应用 1 仪器构成 1 计算机系统 控制着机械 光学 声学系统及各种外围设备 2 激光照射系统 氩离子激光器和声光调节器 3 显微镜系统 它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成 4 检测系统 由检测器 检测放大器等元件组成 5 X Y平台 6 Z 轴步进马达 2 共聚焦成像原理激光器发出的激光束经过光的扩束和整形 变成一束直径较大的平行光束 长通分色光镜使光束偏转90度 经过物镜会聚在物镜的焦点上 样品中的荧光物质在激光的激发下发出沿各个方向的荧光 一部分荧光经过物镜 长通分色反射镜 聚焦透镜 会聚在聚焦透镜的焦点外 经过焦点处的针孔 由检测器接收并转变成电信号 3 光信号接收和成像方式 1 光信号接收生物样品发出的荧光通常有二种接收方式 由光电倍增管 PMT 把光信号转变成电信号 利用电荷耦合器 CCD 把光信号转变成电信号 2 成像方式 载物台运动成像 以直径很小的激光束照射样品 照射点发出的荧光信号经PMT变成电信号 然后载物台移动到下一点 记录该点的荧光强度 该方法无轴向像差 成像时间长 反射扫描成像方式 通过转动反射镜使激光连续照射样品 由CCD摄像机记录下照射点所发射的荧光 成像速度快 4 参数的选择基本参数 Confocal pinhole detector PMT Stepsize Xpoints YPoints scanstr speed LaserPwr Autozoom Display BRsubval Samples pt等 5 性能特点 分辨率高 灵敏度高 扫描速度快 扫描范围大 图像存取方便 可进行光切片的观察 可进行定量荧光分析 6 应用 1 组织光学切片可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列 光学切片 得到其各层面的信息 显微CT 2 三维图像重建 3 细胞物理和生物化学测定 4 荧光的定量 定位分析 5 Ca2 pH及其他细胞内离子的实时定量测定 6 粘附细胞的分选 7 激光细胞显微外科及光陷阱技术 8 荧光光漂白恢复 FRAP 技术 9 胞间通讯的研究 10 细胞膜流动性测定 11 光活化技术 实习1免疫荧光组化 间接法1 4 m石蜡切 58 烤 18h 2 常规脱蜡至水 二甲苯 各10min 无水乙醇 95 乙醇 85 乙醇 75 乙醇各2min 3 PBS洗 磷酸盐缓冲液0 01mol LpH7 4 3 3min 4 0 1 胰蛋白酶 100ml蒸