DNA重组与转座

DNA重组与转座 概述 第一节同源重组 第二节位点专一性重组 第三节转座作用 第四节逆转录转座子 概述 只要有DNA 就会发生重组 减数分裂 高等Euk 体细胞核基因 叶绿体和线粒体 温和噬菌体 转座子转座 生存 变异 突变 重组损伤修复 适应环境 加速进化 广义遗传重组 任何造成基因型变化的基因交流过程 DNA重组 DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合 1 同源重组 2 位点特异性重组 3 转座重组 4 异常重组 DNA重组可分为四类 DNA序列 蛋白质因子 重组DNA技术 第一节同源重组 1 同源重组 homologousrecombination 发生在同源DNA序列之间 一 特征 2 特征 涉及同源序列间的联会配对 且交换的片段较大 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成 存在重组热点 需要重组酶 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号 细线期 合线期 粗线期 双线期 终变期 e g Euk 减数分裂时的染色单体之间的交换细菌的转化 转导 接合 噬菌体重组 双倍体染色体交换 二同源重组的分子模型 1 Holliday于1964年提出Holliday模型 1 两个同源染色体DNA排列整齐 2 两DNA分子同一部位两单链发生断裂引发重组 3 断裂的单链游离末端彼此交换形成Holliday中间体 4 通过分支迁移产生异源双链DNA分子 5 中间体在内切酶和连接酶作用下 形成拼接重组体和片段重组体 Synapsedchromatids Recombinationjoint HeteroduplexDNA 片段重组体 拼接重组体 Holliday中间体 Meselson Radding模型单链入侵模型 链转移模型 置换 侵入 Loop切除 同化异构化分支迁移 5 双链断裂修复模型 2 分枝迁移和Holliday中间体结构的拆分 分枝迁移 branchmigaration 双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散 Holliday的异构化 产生重组体的拆分 Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化 异源双链heteroduplexDNA 重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置 1 2 1 2 Holliday结构的拆分 产生含异源双链的片段重组体 产生拼接重组体 亲本链 片段重组体 拼接重组体 三 原核同源重组 E coli 发生在双方DNA的同源区域 部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间细菌的转化 结合和转导 1 RecBCD酶和Chi位点 RecBCD酶具有ATP依赖的解旋酶活性 依赖于ATP的核酸外切酶活性 序列特异性的单链内切酶活性 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点 Chi位点含有GCTGGTGG序列 是基因recBCD编码RecBCD酶作用的靶位点 RecBCD的识别和切割位点 a RecBCD结合在DNA的平头末端 产生机制不清楚 b 外切 解链 移动 ATP c 兔耳状loop结构产生 再旋酶活性低于解旋酶活性 d RecBCD在loop单链区的chi位点3 方4 6NT处切断单链 单链内切酶 chi位点 GCTGGTGG目前发现的重组热点E coli含1000个 Euk e RecBCD切割产生3 单链末端 2 RecA蛋白 1 活性 a RecA有单 双链DNA结合活性 b RecA有NTPase活性 底物差异活性 与单链DNA结合时活性最大 依赖于DNA c RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力 即联会同源DNA 但其靶DNA必须有缺口 结合DNA RecA引发链侵入模型 RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend RecA启动的单链入侵 RecA引起的链交换和Holliday结构的生成 2 RecA蛋白催化双链和单链DNA的反应阶段 a 联会前阶段 缓慢 RecA与单链结合 b 单链与双螺旋的互补链迅速配对 形成双链连接分子Holliday 5 侵入 c 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA反应结束时 RecA结合到双链上 其中 单链同化有固定的方向入侵单链为5 3 双链DNA的互补链是3 5 RecBCD和RecA的共同作用 3 原核同源重组的其它蛋白 需要E coli中三个基因ruvA ruvB和ruvC的产物 a RuvA识别Holliday结构的连接点 b RuvB为分枝迁移提供动力 ATPase10 20bp s c RuvC核酸内切酶 专一性识别Holliday结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体 E coli重组的各阶段 损伤修复 损伤DNA复制产生缺口 RecA链交换 第二次链交换 DNApol通过DNA合成填满缺口 RuvA B分枝迁移 RuvC切割Holliday连接点 第二节位点专一性重组 一 位点专一性重组 site specificrecombination 1 概念 发生在专一序列的DNA分子间的重组 有特异的重组酶和辅助因子对其识别和作用 噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组 2 位点特异性重组的结果依赖于重组位点的位置和方向 二 phage的整合与切除 1 实现机制 均是通过 细菌DNA和 DNA上特定位点之间的重组 2 特定位点 附着位点 attachmentsiteatt E coliattB含BOB 序列23bp phageattP含POP 序列240bp 核心序列 O区 完全一致 同源部分15bp 位点特异性重组发生的地方 3 整合过程 整合后的附着位点为attL BOP attR POB 整合位点 attB attP切除位点 attL attR 整合过程需要 整合酶 integraseInt 编码 和寄主的整合宿主因子IHF integrationhostfactor 共同作用 溶源性细菌 lysogen 溶菌周期 lysis 原噬菌体 4 整合分子机制 核心序列O全长15bp 富含A T 发生在O内的重组交换位点相距7bp 整合酶的结合位点 attP240bp attB23bp 两者的作用不同 attP位点的负超螺旋为重组所必须 加强了Int和IHF的亲和力 高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构 Int结合 核心序列的反向位点 切割位置 结合在att臂上 臂与核心区靠近 Xis 整合体及其作用整合体 intasome Int和IHF结合到attP时的复合物 整合体捕获attB说明 a attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力b 两序列的同源性在链交换时为重要因素 Int蛋白能切断DNA 并使它重新连接 近而使holliday结构拆分 重组时attP和attB部位交叉断裂 互补单链末端进行交叉杂交 5 整合与切除的控制 1 整合 C 促使阻遏蛋白C 的产生 与intgene的PI结合 转录产生Int蛋白 且PI位于xis基因内 C 与PI结合导致xisgene失活 2 切除 寄主SOS反应时 RecA大量产生 促使阻遏蛋白C 的水解 把OL和OR从阻遏状态释放出来 从PL转录使int和xis表达 细菌的特异位点重组 鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白H1和H2转换 四 依赖于同源重组的位点特异性的序列代换 酵母MAT序列的转换 1 酵母结合型的转变 DNA序列的代换 而不是互换 依赖于序列的同源性 被代换的序列命运是被降解 突变试验 2 同源序列 匣子WXYZ1Z2totalHML 723704747239882501MAT 723704747239882501MATa723704642239882369HMRa704642239881585 3 转换过程 内切酶 HO 识别 切割 Y Z1交界处 起始MAT序列的转换 双链断裂 HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护 Y区域被降解 直到Y 和Ya相同的部分或一直到X区域 四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对 以供体DNA为模板复制Y区域 holliday结构形成 Holliday结构的拆分 产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子 4 特征 同源重组和位点特异性重组特征都具有 需要大范围的同源序列 需要重组酶系 rad52基因产物 位点特异性的HO内切酶 第三节转座作用 一 转座子概述 1 转座子 元 或转座元件 transposonortransposableelement 基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段 它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点 供体和受体 转座 transposition 转座子的转移过程 2 发现和发展 1914A Emerson1936Marcus M Rhoabes玉米果皮 糊粉层花斑突变 玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理 跳跃基因 jumpinggene 1947冷泉港实验室 美 BarbaraMcClintock 基因转座现象的再次发现与证实 在一个操纵子中 与操纵基因毗连的结构基因发生终止突变后 它除了影响该基因本身产物的翻译外 还影响其后结构基因多肽的翻译 并且具有极性梯度的特征 插入型极性突变的发现与机理 Operon PolarityMutation 20世纪60年代末期 在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子1983年BarbaraMcClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖 a 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性 b 转座不是简单的转移 涉及转座子的复制 Hotspots 热点 Regionalpreference 在3kb区域内的随机插入 d 某些转座因子 Tn3 对同类转座因子的插入具有排他性 免疫性 e 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复 f 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应 3 转座重组的特点 c 转座插入的靶位点并非完全随机 插入专一型 二 Prok 转座子种类 两种类型 简单转座子 simpletransposon 插入序列insertionsequenceIS 复合转座子 compositetransposon 共同特征 a 两端有20 40bp的IRb 具有编码转座酶 transposase 的基因 1 插入序列 最简单 是细菌染色体 质粒和某些噬菌体的正常组分 命名 IS 编号 鉴定类型 长度700 2000bp 特点 a 两端IR为转座酶的识别位点 突变 b 插入靶位点后会出现靶位点的正向重复 3 9bp IS可以正反方向插入到DNA 宿主 质粒或某些噬菌体 常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应 a Tn TnAfamily l具有IR 转座酶基因 调节基因 解离酶 抗抗生素基因 lTn1 AmpR Tn2 AmpR Tn3 AmpR Tn4 AmpRStrR Tn5 KanR Tn6 kanR Tn7 StrRTmpR Tn9 CamR Tn10 TetR 2 复合转座子 两种类型 b 两端重复序列为IS的复合转座子 e g IS插入到功能基因两端 可能形成复合转座因子 transposition 当两个IS组件相同时 其中任一个都可行使转座功能 不同时 主要依靠一个 两侧的IS既可以是IR 又可以是DR状态 IR多 3转座噬菌体Muphage 巨型转座子 CrepressorforA BB33kd与转座有关A70kd转座酶U S毒性蛋白attL attR与寄主同源 反向重复 转座必需GinG区倒位酶 以E coli为寄主的温和型噬菌体 溶源 裂解 Mu的插入途径 a 侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA 两侧各5bp的靶位点序列重复 b 进入裂解生长后 复制产生后代MuDNA几乎全部插入寄主DNA中 并可继续转座 形成寄主DNA和Mu的共合体 噬菌体成熟时 切段共合体包装 三 转座子的转作机制及模式 三种类型 复制型 非复制型和保守型 1 复制型转座模式 实质 转座子元件被复制并被移动到受体位点 最终转座过程扩增了转座子的拷贝 供 受点 需两种酶 转作酶 作用于原拷贝两末端 解离酶 作用于复制后的拷贝 模式 两大步 a 共合体形成切口 连接 复制 b 拆分 靶位点的DR形成 2 非复制型转座模式 供体上最终产生双链断裂 供体位点如不能被修复则有致死效应 3 保守型转座模式 另一种非复制型 与 整合机制相似其转座酶与 整合酶家族有关 4 TnA转座模式 复制型转座转座酶 tnpA 解离酶 tnpR 解离酶需要特异的内部位点双重功能 解离功能tnpA及自身的阻遏物 拆分位点 res共合体拆分位点 转座结果产生5bp的正向重复序列 四 转座子转座频率的调控 每个转座子控制自身转座的核心 控制转座酶的水平 1 Tn10转座机制 Tn10为复合型转座子 IS10R元件提供转座酶活性 合成转座酶的序列 自发转座频率 10 7 Tn10转座酶水平是控制转座的关键 有两种控制转座的方式 a 通过反义RNA的翻译水平控制 IS10R外侧边缘两个启动子 PIN控制IS10R的转录弱启动子 POUT 强启动子右向转录宿主DNA INRNA和OUTRNA有36bp的重叠稳定性 OUTRNA INRNA 大量OUTRNA作为INRNA的反义RNA b 甲基化作用控制转座酶合成及其与DNA的结合 Tn10转座酶启动子含有GATC序列 其它转座子 E coli中Dam甲基化酶作用使启动子相对钝化只能利用刚刚复制完成时出现少数转座酶 此外 IS10R的末端IR也含有GATC 甲基化的GATC不能结合转座酶 Tn10在DNA刚刚复制后发生转座 五 转座子的某些遗传学效应 1 转座频率10 8 10 3 引起插入突变 2 插入位置染色体重排而出现新基因 3 影响插入位置邻近基因的表达 使宿主表现型改变 4 引起染色体插入位点两侧染色体畸变 真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类 a 转座机制与细菌的转座子类似遗传信息 DNA DNA 玉米的Ac Ds元件 果蝇的P元件和FB元件等 b 转作机制类似逆转录病毒遗传信息 RNA DNA RNA 如 逆