高效液相色谱法EP4.doc

EP 4 通用方法 色谱法 1 2 2 29 液相色谱法 液相色谱法 EP4 液相色谱法 LC 是一种根据两种互不相溶的相之间种类分布的不同而进行色谱分离的 方法 在这两种互不相溶的相中 移动相是一种渗过色谱柱中固定相的液体 液相色谱法 LC 主要基于吸附 质量分布 离子交换 尺寸排阻或立体化学相互作用 的原理 仪器仪器 液相色谱法的仪器包括 泵系统 进样器 色谱柱 可用柱温控制器 检测仪和数据 采集系统 也可用积分仪或图形记录器 移动相从一个或多个贮器流出 通常以恒速经过 色谱柱 再流经检测仪 泵系统泵系统 液相色谱法所用的泵系统需以恒定流速输送移动相 应尽量减少压力波动 如将加压溶 剂通过脉冲减幅装置进行传送 管道和接头要能承受泵系统产生的压力 液相色谱泵可以与 能将系统中裹入气泡排出的设施相连接 微处理器控制系统能根据设定好的程序准确地输送恒定 等度洗脱 或不同成分 梯度 洗脱 的移动相 梯度洗脱时 泵系统从多个贮器发送溶剂 将泵调到低压或高压即可对溶 剂进行混和 进样器进样器 用可在高压下使用的进样系统在 或靠近 色谱柱顶部将样品溶液注入流动着的移动相 中 使用手动操作的固定回路变量装置或自动进样器进样 手动分次注入回路会降低进样量 的精确度 固定相固定相 液相色谱法中使用的固定相有多种 包括 二氧化硅 氧化铝或多孔石墨 用于正常相色谱法 该方法是根据吸附和 或 质量分 布的不同进行分离 树脂或带酸基 或碱基 的多聚体 用于离子交换色谱法 该方法是在待分离的离子与 移动相中的离子之间的竞争基础上进行分离 多孔硅石或多聚体 用于尺寸排阻色谱法 该方法是根据分子量之间的不同进行分离的 与空间排阻法色谱法相对应 多种由多聚体 硅石或多孔石墨经过化学变性的固定相 用于反相液体色谱法 该方法 是主要根据移动相和固定相之间的分子隔离来进行分离 经过特殊化学变性的固定相如纤维素或直链淀粉衍生物 蛋白质或肽 环糊精等 用于 旋光对映体的分离 手性色谱法 大多数分离都基于一种隔离机制 即用化学变性硅作固定相 用极性溶剂作移动相 载 体 如二氧化硅的硅烷醇基 的表面与各种硅烷试剂发生反应 在载体表面产生以共价键联 EP 4 通用方法 色谱法 2 系的 覆盖大量活动部位的甲硅烷基衍生物 键合相的性质是确定色谱系统分离性能的一个 重要参数 现将常用的键合相列于下表中 辛基 Si CH2 7 CH3C8 十八烷基 Si CH2 17 CH3C18 苯基 Si CH2 n C6H5 C6H5 氰基丙基 Si CH2 3 CNCN 氨基丙基 Si CH2 3 NH2NH2 二醇 Si CH2 3 OCH OH CH2 OH 除非制造商另有说明 使用二氧化硅的反相色谱柱在 pH 值为 2 0 8 0 的移动相中是 稳定的 而装有多孔石墨或聚合物颗粒 如苯乙烯 二乙烯基苯共聚物 的色谱柱在更宽的 pH 值范围内是稳定的 在某些情况下 可用未改性的二氧化硅 多孔石墨或化学变性的极性硅 如氰基丙基或 二醇 做固定相 加上非极性移动相进行正常相色谱分析 用于分析分离时 最常用的移动相的粒度为 3 m 10 m 不等 移动相的颗粒可以是不 同孔径和比表面积的球状或不规则形状 这些参数构成了固定相的色谱特性 就反相来说 其固定相的性质 键合程度 如以载碳表示的 以及该固定相是否有尾帽 即残留的甲硅烷 醇基已被甲硅烷基化 仍是其决定因素 当残留甲硅烷醇基存在时 会产生拖尾峰 特别是 碱性物质的拖尾峰 除非专论中另有规定 分析色谱法中使用的色谱柱应为不锈钢 其长度和内径各异 内径小于 2mm 的柱子通常叫做微孔柱 分析时 移动相和柱子的温度必须保持恒定 大多 数分离是在室温下进行的 但是可以给柱子加热 提高柱效 在给柱子加热时 建议温度不 超过 60 C 以免固定相老化或移动相的成分发生变化 移动相移动相 对正常相色谱分析法来说 其使用的极性溶液要少些 严格控制移动相中的水份 才能 得到可再现的结果 而在反相液相色谱分析法中 则使用水性移动相 有机改性剂可有可无 移动相的组份通常需过滤 除去大于 0 45 m 的微粒 多组份的移动相的制备方法是 除非规定了质量 量取各组份所需体积后进行混和 或者 可以用配量阀控制的单个泵来 输送溶剂 所需的溶剂在配量阀中按比例进行混和 泵送前 通常用喷射氦 音波或在线膜 或真空模块 的方式以避免在检测器中产生气泡 从而脱去溶剂中的气泡 配制移动相所有的溶剂通常不含稳定剂 若用紫外检测器 其在检测波长上应是透明的 所用溶剂及其他成份的质量应合适 如需调节 pH 时 只能用移动相中的水性成份 而不是 混合物来调节 使用缓冲液时 在色谱分析结束后 用移动相 5 V V 中的水和有机改 性剂的混合物适当冲洗色谱系统 防止盐类结晶 移动相也可以含有其他成份 如进行离子对色谱分析时用反离子 用非手性固定相进行 色谱分析时用手性选择器等 EP 4 通用方法 色谱法 3 检测器检测器 紫外 可见 UV Vis 分光光度计 包括二级管阵列检测器 是最为常用的检测器 也可用荧光分光光度计 差示折光计 电化检测器 质谱仪 光散射检测器 放射性检测器 或其他特殊检测器 方法方法 在室温或专论中规定的温度下 用规定的移动相和流速平衡色谱柱 直到出现稳定的基 线 配制所需的待检品溶液和参照溶液 配制的溶液中不得有固体颗粒 衡量系统稳定性的标准在 色谱分离技术 2 2 46 一章中有描述 调整色谱系统 的参数以满足系统适应性标准 其调整幅度也在同一章节中进行了描述 2 2 46 色谱分离技术色谱分离技术 EP4 色谱分离技术为多级分离方法 供试品的组份分布在 2 个相之间 一个是固定相 另一 个是移动相 固定相可以是固体或以固体或凝胶为载体的液体 固定相可装载于色谱柱中 摊开作为一个层 或以膜等形式分布 移动相可以是气体 液体或超临界流体 可以在吸附 质量分布 分隔 离子交换等基础上进行分离 或根据分子的理化特性 如大小 质量 体积等等 的不同进行分离 本章描述了系统适应性中普通参数的定义 计算以及普遍要求 其分离原则 仪器和方 法在下列通用方法中有具体描述 纸色谱法 2 2 26 薄层色谱法 2 2 27 气相色谱法 2 2 28 液相色谱法 2 2 29 尺寸排阻色谱法 2 2 30 超临界流体色谱仪 2 2 45 定义定义 下述定义常被用来计算专论中的限量 具备某些设备之后 某些参数如信噪比 即可用生产厂家提供的软件进行计算 用户有 责任确保软件中所使用的计算方法符合欧洲药典的要求 否则 必须做适当修改 色谱图色谱图 色谱图是监测器反应 用于测量流出物浓度或其他数量相对于时间 体积或距离的一种 图形或其他表示 理想化的图谱是由基线上连续的高斯峰来表示的 保留数据保留数据 保留时间及保留体积保留时间及保留体积 洗脱色谱法的保留测量可由直接由色谱图中最大峰的位置的保留时间 tR 来表示 从 保留时间中可计算出保留体积 VR EP 4 通用方法 色谱法 4 tR 从注样点到与该组份相应的最大峰落下的垂直线之间的 沿基线的保留时间或 距离 v 移动相的流速 质量分布率质量分布率 质量分布率 Dm 也叫容量因子 k 或保留因子 k 定义如下 M S Cm V V KD 移动相中溶解物的量 固定相中溶解物的量 KC 平衡分布系统 也叫分布常数 VS 固定相的体积 VM 移动相的体积 用下式确定色谱图中某个成份的质量分布率 tR 从注样点到与该组份相应的最大峰落下的垂直线之间 沿基线的保留时间 或 体积 或距离 tM 滞留时间 或体积 从注样点到与未保留组份相应的 峰最高处落下的垂 直线之间 沿基线的时间 或体积 或距离 分布系数分布系数 一种组份在尺寸排阻色谱分析法的色谱柱中的洗脱特征可由分布系数 Ko 来确定 tR 从注样点到与该组份相应的最大峰落下的垂直线之间 沿基线的保留时间 或 体积 或距离 to 滞留时间 或体积 从注样点到与未保留组份相应的 峰最高处落下的垂 直线之间 沿基线的时间 或体积 或距离 tt 从注样点到与能完全通过固定相的组份的最大峰落下的垂直线之间 沿基线的 保留时间 或体积 或距离 阻滞因素阻滞因素 推迟因子 RF 也叫保留因子 Rf 用于平面色谱法中 是从应用点与到斑点中心 的距离与溶剂前沿飘离应用点的距离之比 b 被测物的飘移距离 a 溶剂前沿的飘移距离 EP 4 通用方法 色谱法 5 色谱数据色谱数据 峰可用峰面积 A 或峰高 h 和半高峰宽 wh 或峰高 h 和屈曲点之间的峰宽 wi 来定义 在高斯峰中 图 2 2 46 1 其关系如下 图 2 2 46 1 对称因子对称因子 一个峰的对称因子 As 或拖尾因子 图 2 2 46 2 是从下式中计算的 w0 05 在峰高二十分之一处的峰宽 d 从峰最高处落下的垂直线与在二十分之一峰高处峰前沿之间的距离 值为 1 0 时表示完全 理想的 对称 Figure 2 2 46 2 柱子的性能及视在理论板数柱子的性能及视在理论板数 柱子性能 视在效率 根据所用的技术 可根据等温线 等度 或等密度线 条件得 出的数据进行计算 从下式中得出的理论板数 N 其中 tR 和 wh 值必须用同样的单位 时间 体积或距离 表示 tR 从注样点到与该组份相应的最大峰落下的垂直线之间 沿基线的保留时间 或 体积 或距离 EP 4 通用方法 色谱法 6 wh 半高峰宽 理论板数随组份 柱子和保留时间的不同而有所不同 分离数据分离数据 分离度分离度 同样高度的两个组份峰之间的分离度 Rs 可用下面的公式计算 tR1和 tR2 从注样点到两个相邻峰最高处落下的垂直线之间沿基线的保留时 间或距离 wh1 和 wh2 半高时的峰宽 分离度大于 1 5 时符合基线分离 当各峰之间的高度完全不同时 上述给出的公式可能不适用 在定量平面色谱分析法中 用迁移距离来代替了保留时间 其分离度可以用下列表达式 进行计算 RF1 和 RF2 从应用点到斑点中心的距离与溶剂前沿飘离应用点的距离之比 阻滞因子 wh1 和 wh2 半高时的峰宽 A 溶剂前沿的迁移距离 峰谷比峰谷比 在相关物质的检验中 当杂质未从被分析物中完全分离出来时 峰谷比 p v 可作为一 种系统适用性要求 图 2 2 46 3 Hp 由于杂质影响 峰在推定基线以上的高度 Hv 由于杂质和被分析物的影响 在推定基线以上分离峰的曲线最低处的高度 EP 4 通用方法 色谱法 7 Figure 2 2 46 3 相对保留相对保留 相对保留 R 是从下列表达式的估算中得出的 tR2 感兴趣的峰的保留时间 tR1 对比峰 通常指与供试品相对应的峰 的保留时间 tM 滞留时间 或体积 从注样点到与未保留组份相应的 峰最高处落下的垂 直线之间 沿基线的时间或距离 在平面色谱分析法中 用滞留因子 RF2 和 RF1 代替了 tR2 和 tR1 定量精确度定量精确度 信噪比信噪比 信噪比 S N 影响到定量分析的精确度 是用下列公式计算的 H 在色谱图中 用规定的标准溶液 在相当于 20 倍半高宽的距离中观察到的 从峰的最高处至信号的推定基线之间 对应于被测组份的峰高度 图 2 2 46 4 h 色谱图中注样后或使用空白后所得到的背景噪音范围 是在色谱图中相当于 20 倍该峰的半高宽范围内观察到的 该色谱图是用规定的标准溶液得出的 如可 能的话 对称分布于该峰周围 Figure 2 2 46 4 重现性重现性 响应的重现性是以连续的 一系列的进样测量或使用标准溶液后得到的估计百分数相对 标准偏差 RSD 来表示 并用下列表达式来计算的 EP 4 通用方法 色谱法 8 yi 用内标法测出的峰面积 峰高或面积比的值 各值的平均值 n 各值的数目 最大允许的相对标准偏差 RSDmax 是从一系列标准溶液进样后 用下述表达式计算的 定义限量 K 从 式中得出的常数 0 349 式中 表示进 6 针样后 为 达到 B 1 0 而需要的 RSD B 专论中定义的上限减去 100 假定是按该方法的再现性进行设置的 n 平行注入标准溶液的数目 3 n 6 t90 n 1 在 90 的概率水平上 研究者的时间 t 双面 和 n 1 自由度 系统适应性系统适应性 系统适应性试验是本方法的一个整体部份 用来确保色谱系统的确切性能 视在效率 质量分布比率 分离度 相对保留和对称因子都是通常用来评价柱子性能的参数 可能影响 色谱行为的因素包括移动相的构成 离子强度 温度和 pH 值 流速 柱子长度 温度 压 力 以及固定相的特征包括多孔性 粒度 颗粒类型 比表面积 在反相载体中 则是化学 改良的程度 用尾帽 载碳等等表示 所使用设备的不同组件必须合格 能达到做测试和化验所需要的精度 除非专论中另有规定 应达到下列要求 除非专论中另有规定 主峰的对称因子应在 0 8 到 1 5 之间 此要求普遍适用于药典中所 描述的检验或化验 规定的标准溶液重复进样的相对标准偏差最大不超过表 2 2 46 1 所规定的值 此要求仅 适用于含量测试 不适用于相关物质的检验 峰 对应于信噪比为 3 时 的检测限量应低于相关物质检验中忽略限量 报告阈值 峰 对应于信噪比为 10 时 的定量测试限量相当于或低于相关物质检验中忽略限量 报告阈值 Table 2 2 46 1 重现性要求 单独进样的次数 EP 4 通用方法 色谱法 9 3456 B 最大容许的相对标准偏差 2 00 410 590 730 85 2 50 520 740 921 06 3 00 620 891 101 27 色谱条件的调整色谱条件的调整 色谱分析测试中 在基本不改变该分析方法的前提下 现将调整各参数以满足系统适应 性条件的调整幅度列出供参考 所述的色谱条件已在专论中进行了验证 包括系统适应性试 验 以确保顺利进行检验或化验所需的分离 不过 由于固定相是以概述的方式进行描述 的 市场上能买到的固定相种类也很多 它们的色谱性能也不相同 因此有必要对色谱条件 进行一些调整 以便达到所规定的系统适应性要求 特别是在使用反相液相色谱法时 即 使调整了不同的参数 也不一定会有满意的色谱 在这种情况下 有必要换上不同厂家生产 的 同样型号的柱子 如十八烷基甲硅烷基硅胶 从而显示所需的色谱特征 关键参数的调整在专论中已有详尽描述 以确保符合系统适应性 应避免有可能对系统性能产生累积影响的多次调整 薄层色谱法和纸色谱法薄层色谱法和纸色谱法 移动相的组成移动相的组成 微小溶剂成份的数量可在 30 的相对范围 或 2 的绝对范围内进 行调整 以较大者为准 其他成份的调整不得超过 10 的绝对范围 移动相中水性成份的移动相中水性成份的pH值 值 0 2 pH 除非专论中另有规定 或 测定中性物质时 1 0 pH 移动相的缓冲成份中盐的浓度移动相的缓冲成份中盐的浓度 10 应用体积应用体积 使用精细粒度碟 2 10 m 时 将规定体积减少到 20 溶剂前沿的飘移距离溶剂前沿的飘移距离不得少于 50 mm 液相色谱法液相色谱法 移动相的组成移动相的组成 微小溶剂成份的数量可在 30 的相对范围 或 2 的绝对范围内进行调整 以较大者为准 其他成份的调整不得超过 10 的绝对范围 移动相中水性成份的移动相中水性成份的pH值值 0 2 pH 除非专论中另有规定 或 测定中性物质时 or 1 0 pH 移动相的缓冲成份中盐的浓度移动相的缓冲成份中盐的浓度 10 检测器波长检测器波长 不得调整 固定相固定相 EP 4 通用方法 色谱法 10 柱长 70 柱子内径 25 粒度 不得小于 50 不得再小 流速流速 50 温度温度 10 最高不得超过 60 C 进样体积进样体积 只有在测定峰的检测和重现性满意时才可以减少 梯度洗脱梯度洗脱 对所使用设备进行重新配置 可能会严重改变方法中所描述的分离度 保留时 间和相对保留 发生重大改变时 有可能是因为过大的停留体积 即两种洗脱液的交汇点与 柱子顶部之间的体积 气相色谱法气相色谱法 固定相固定相 柱长 70 柱子内径 50 粒度 最多可减少 50 不允许再增加 膜厚度 50 100 流速流速 50 温度温度 10 进样量进样量 只要监测结果和重现性满意 可减少 超临界流体色谱法超临界流体色谱法 移动相的组成移动相的组成 对已装填好的柱子 微小溶剂成份的量可按 30 相对范围或的 2 的绝对 范围进行调整 以较大者为准 不允许对毛细管柱系统进行调整 检测器波长检测器波长 不允许调整 固定相固定相 柱长 70 柱子内径 25 已装填好的柱子 50 毛细管柱 粒度 最多能减少 50 不允许再减少 已装填好的柱子 流速流