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医学微生物学实验指导皖南医学院微生物学和免疫学教研室2006年5月微生物学实验的目的与要求医学微生物学的实验课是本课程学习中的重要环节。医学微生物学实验课的目的：在于使学生加深和巩固对讲课内容的理解和体会，并在系统学习理论的基础上，使学生学习并掌握微生物学的基本操作技术，培养独立思考的能力，为今后的临床实践及科学研究工作打下良好的基础。为了提高实验课的效果，应做到以下几点：一、每次实验前作好预习，明确实验目的，内容，操作中注意点及其理论依据，避免或减少错误发生。二、在实验过程中，应持严肃认真的科学态度，并要注意合理地分配和利用时间。三、在微生物学的整个实验过程中，应严格加强“无菌观念”的培养和训练。四、实验结果须真实记录，进行分析，得出结论。如实验结果与理论不符，应探讨原因，训练科学思维的能力。实验完成后，要写出实验报告。微生物学实验室规则微生物学实验的对象大多是病原微生物，因此必须严格贯彻“无菌观念”，防止实验中自身感染和环境污染是微生物学实验室的最重要原则。一、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应立即报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后立即投入已准备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。实验一 自然界与人体的微生物检查实验目的：了解微生物在空气、物体表面及正常机体表面的分布，增强消毒及无菌操作的观念。实验材料：普通琼脂平板、无菌棉棒、无菌生理盐水、蜡笔、酒精灯。实验内容：一、空气中微生物的检查：取无菌普通琼脂平板一只，打开后暴露在空气中，30分钟后盖好，置37温箱孵育24小时，观察各种菌落的特征。二、皮肤、粘膜及其它物品表面微生物的检查：取普通琼脂平板一只，用蜡笔在皿底玻璃上划分四区，将标签纸贴于正中，分别注明皮肤、粘膜、硬币或钢笔等字样。然后反转，打开平板：1、 用手指在注明“皮肤”处琼脂上轻轻擦拭。2、 把沾取了无菌生理盐水的湿棉棒在管壁上挤干水，擦拭咽部或鼻腔粘膜，然后轻轻抹在“粘膜”处琼脂上。3、分别取硬币或钢笔等物在相应区域内抹擦。盖好平板，置37温箱内孵育24小时后，观察菌落的生长情况。实验报告： 观察与记录结果。实验二 油镜的使用实验目的：熟悉显微镜的使用方法。实验材料：标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。实验原理：使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片空气透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。 D C B A 油 空 气 玻璃 空气 A B C D图1 油镜的原理示意图实验方法：1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影响观察造成污染。2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采用直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度很强。3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。4、低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。5、观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。6、显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形，集光器下降，反光镜推平，光圈关上，归还显微镜室。实验三 细菌的基本形态和特殊结构实验目的：掌握细菌的基本形态和特殊结构。材料及方法：一、细菌的基本形态（示教）1、球菌：葡萄球菌，革兰氏染色阳性。2、杆菌：大肠杆菌，革兰氏染色阴性。3、弧菌：霍乱弧菌，革兰氏染色阴性。二、细菌的特殊结构（示教）1、荚膜：肺炎球菌，成双排列，菌体四周不着色的透明圈即是荚膜所在处。经荚膜染色后，菌体与背景呈现紫色，荚膜为无色。2、鞭毛：伤寒杆菌，菌体四周有周鞭毛。经鞭毛染色后，菌体和周鞭毛均呈紫色。3、芽胞：破伤风杆菌，菌体细长，顶端可见一正圆形芽胞。经芽胞染色后，菌体为蓝色，芽胞为红色。实验报告：1、绘图说明各种形态细菌的大小、形态、排列方式，并注明染色性及放大倍数。2、绘图说明细菌的特殊结构，并注明染色性及放大倍数。实验四 基础培养基的制备培养基是根据微生物生长繁殖时对营养物质的需要而配制的营养制品，含有营养物质及适宜的酸碱度，经灭菌后使用。常用的培养基按用途分为：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基及厌氧培养基。按物理性状分为固体、半固体和液体三种。实验目的：了解常用的液体、固体、半固体培养基的成分、制备方法和用途。实验材料：牛肉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、0.1mol/lNaOH溶液、酚红指示剂、蒸馏水等。实验方法：一、肉汤培养基1、 将鲜牛肉除去筋膜和脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎，以每500g碎牛肉加1000ml蒸馏水的比例混合后，置4冰箱过夜。2、 次日取出浸泡物倒入容器内煮沸半小时，使肉渣凝固，也可煮沸一小时不经冰箱过夜。3、 用纱布和脱脂棉过滤，除去肉渣，即成肉浸汁。加入1%蛋白胨及0.5%氯化钠，加热溶解并用蒸馏水补足蒸发失去的水分。4、 待冷至50左右时，调该溶液的pH至7.47.6。校正pH的方法为：取三支与标准比色管（pH7.6）相同的空比色管，其中一管内盛放蒸馏水5ml；另外两管各加入欲测的肉汤培养基5ml，其中一管内加0.02%酚红指示剂0.25ml（滴定管），摇匀。按图2所示排列，举起比色架，对光观察。若滴定管色调较淡或为黄色，即表示培养基偏酸性，需滴加0.1mol/L NaOH矫正；若呈深红色，即表示偏碱性，应滴加0.1mol/L HCl矫正；使之与标准比色管色泽相同为止。通常未矫正前的肉汤均呈酸性。记下用去的NaOH（或HCl）溶液量，由此计算出矫正全量培养基时所需NaOH（或HCl）溶液量。图2 pH比色架5、 酸碱度矫正后，加热煮沸10分钟，用滤纸过滤，补足水分，再调一次pH值。6、 分装肉汤于三角烧瓶或试管，瓶口、管口加棉塞并用纸包扎。7、 置高压灭菌器内103.43Kpa20分钟灭菌备用。可用市售的牛肉膏代替牛肉，用量为0.3%，其余成分相同（如蛋白胨、氯化钠等）加热溶解，调节pH至7.6左右，煮沸10分钟，补充失水、过滤、分装，灭菌后备用。二、固体培养基1、在上述制备的肉汤中加入2-3%的琼脂。琼脂为海藻中提取的一种多糖类物质，本身无营养作用，不能被细菌利用。因其加热到100后可溶化，冷却至40左右又可凝固，故可作为赋形剂。加热溶化，脱脂棉过滤，补足失水，分装三角烧瓶和试管。2、置高压灭菌器内103.43Kpa灭菌20分钟，取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，待琼脂凝固即成琼脂斜面培养基（图3）。三角烧瓶内培养基冷至50-60时在超净台或无菌室内将其倾注于灭菌平皿内（15-20ml），凝固后即成琼脂平板。图3 琼脂斜面培养基另外，实际工作中现多使用合成营养琼脂干燥粉末制剂。其方法为：称取41克营养琼脂干燥粉末加入1000ml冷蒸馏水中混合放置10分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸使其完全溶解，分装于中试管中（约57ml）或三角烧瓶，103.43kPa（121）灭菌15分钟，即可备用。三、半固体培养基1、操作方法同固体培养基，但琼脂加入量较少，仅0.3-0.5%。2、分装试管，灭菌后使试管直立，冷凝后即成半固体培养基。实验五 细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。用途： 分离出纯种细菌，以利作纯培养。操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。图4-1 平板分区划线法图4-2 培养后菌落分布情况二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。1、 左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。2、 将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。3、 管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。三、半固体穿刺接种法用途：观察细菌动力，保存菌种。方法：1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。 图5 液体（左）及半固体（右）培养基接种法四、斜面培养基接种法用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。操作方法：1、 以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。2、 管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37温箱孵育18-24小时，取出观察斜面上菌苔生长情况。 图6 斜面培养基接种法实验报告：详细记录细菌在各种培养基中生长后的表现。实验六 病原性球菌的检查（一）实验目的：1了解病原性球菌的检查程序。2掌握细菌涂抹标本制备和革兰氏染色法。3掌握病原性球菌的形态和分离培养法。实验材料：病原性球菌的形态、脓汁标本、革兰氏染色液、普通平板、血平板、玻片、接种环、酒精灯、光学显微镜、香柏油、吸水纸、擦镜纸、标记笔。实验内容：一、病原性球菌的检查程序病原性球菌常引起化脓性疾病，分离用标本多采用脓、痰液，但也可从分泌物、血液及穿刺液中取材。1、标本采集（1）脓液：用无菌棉拭挑取患部深处脓液或分泌物，放入无菌试管内。（2）痰液：用消毒过的容器收集病人痰液，以无菌棉拭挑取浓稠痰块，放入无菌试管。（3）咽部分泌物：嘱病人张开口，用压舌板轻压舌根部，以无菌棉拭从鼻咽部位擦拭取材，然后将其放入无菌试管。（4）血液：高热、败血症患者作血液检样时，最好在发热时，抗菌药物治疗前采取，这时培养阳性率最高。取血35毫升，立即以无菌手续注入3050毫升（使血与培养基之比约等于110）的葡萄糖酚红肉汤增菌培养基中。（5）脑脊液：对疑患流脑的患者作腰椎穿刺取脑脊液（CSF），脑脊液取出后应盛于无菌容器内，立即送检。（6）尿道、阴道分泌物：对淋病可疑患者，男性可从尿道取材，取材时应进入尿道12cm，如刚排尿，应等待1小时左右。女性则可从宫颈口取分泌物，当插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转12分钟拿出，取材应立即送检，不可放置冰箱。2、分离与鉴定待检标本可直接作涂片染色检查鉴定，必要时可作分离培养及生化反应，致病性鉴定。常见致病性球菌的检查程序如下。 直接涂片、革兰氏染色、镜检（形态、排列、染色性） 观察菌落性状、溶血性、色素脓、痰、分泌物 涂片、染色、镜检穿刺液、脑脊液 生化反应 血琼脂平板 挑取可疑菌落 纯分离 致病性测定 药敏试验血液、尿、胆汁肉汤增菌培养3717天 培养液混浊或溶血时，涂片、染色、镜检 二、涂片染色镜检 （一）涂抹标本制备方法：1、涂片：取洁净的载玻片一张，用蜡笔标记，接种环灭菌后，以接种环取浓汁标本1-2环，置于玻片的中央，涂成直径约1cm的均匀薄膜涂片。如用固体培养物，须先加生理盐水，再将细菌少许与生理盐水混匀。2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将涂片膜面向上，小心间断地在弱火高处略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检测。3、固定：涂片干燥后，手持玻片一端（涂膜面向上）在酒精灯上快速地来回通过三次，共约23秒钟，注意温度不可太高，以玻片涂膜的反面触及皮肤觉烫而尚能忍受为度。固定的目的一是杀死细菌；二是使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；三是使菌体蛋白变性易着色（见图142）（二）革兰氏染色法革半氏染色法（Gramstain）是丹麦细菌学家革兰（Christain Gram）于1884年发明的，至今已逾百年，但仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。其基本过程是标本经固定后，先用结晶紫初染，再用革兰氏碘液媒染，然后用95%酒精脱色，最后用石炭酸复红稀释液复染。此法可将细菌染成两大类：不被酒精脱色仍保留紫色的为革兰氏阳性菌，被酒精脱色后复染成红色的为革兰氏阴性菌。1、原理：革兰氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三种学说：等电学说：革兰氏阳性菌等电点（Ph23）比革兰氏阴性菌（Ph45）低，一般染色时染液的酸碱度在Ph7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。通透性学说：革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。革兰氏阴性细菌细胞壁疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫-碘复合物容易被乙醇溶解而脱出。化学学说：革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它和染料-媒染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色。2、革兰氏染色液的配制：结晶紫染液：结晶紫14.0g，溶于95%酒精100ml中，制成结晶紫酒精饱和液。取出此饱和液20ml与1%草酸铵水溶液80ml混匀。碘液：先将碘化钾2.0溶于约2ml蒸馏水中，再加碘片1.0g，略加振摇，待碘片完全溶解后，再加蒸馏水至总量为300ml。稀释石炭酸复红染液：取碱性复红10.0g或碱性复红（新）4.0g溶于95%酒精100ml中，配成碱性复红酒精饱和液；取此饱和液10ml与5%石炭酸水溶液90ml混匀，配成石炭酸复红原液；取此原液10ml加入蒸馏水90ml中混匀，即成稀释石炭酸复红染液。3方法：初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴室温作用一分钟后，用细流水轻轻冲洗。媒染：滴加媒染剂碘液数滴，室温作用一分钟，用细流水冲洗。脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍淡紫色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。复染：滴加稀释石炭酸复红液复染约30秒钟后用细流水冲洗。镜检：标本染色后，凉干，滴香柏油，用油镜观察，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。三、平板划线接种法（分离培养法）见细菌分离与培养。实验报告：记录革兰氏染色结果；记录三区划线结果。实验七 病原性球菌检查（二）实验目的1掌握病原性球菌培养物性状。2掌握血浆凝固酶试验原理方法。3掌握密集接种法，熟悉药物（如抗生素）抑菌杀菌原理并了解纸片法、试管法的试验方法及应用。实验材料1、菌种：金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌68小时肉汤培养物。2、培养基：普通琼脂平板、肉汤培养基。3、药品：青霉素溶液（50u/ml）、抗生素滤纸片。4、器具：恒温箱、接种环、酒精灯、试管、无菌棉拭、无菌小镊子、无菌吸管、玻片、血浆。实验内容一、病原性球菌的培养物观察肉眼观察葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌在血琼脂平板上的生长情况及脑膜炎球菌在巧克力（色）琼脂平板上的生长情况，比较菌落的形态特征。（1）葡萄球菌：在血琼脂平板上培养1824小时，形成圆表凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐，菌落不透明。金黄色葡萄球菌金黄色，可产生透明溶血环；表皮葡萄球菌白色、无溶血环，腐生葡萄球菌白色或柠檬色，无溶血环。（2）链球菌：在血琼脂平板上培养1824小时，形成灰白色、圆形凸起、半透明或不透明的细小菌落。甲型溶血性链球菌不完全溶血，在菌落周围形成草绿色溶血环，乙型溶血性链球菌完全溶血、形成透明溶血环，丙型链球菌不发生形成圆形、光滑隆起透明似露珠的菌落。在血琼脂平板上不发生溶血溶血、无溶血环。（3）肺炎球菌：血琼脂平板上培养1824小时，形成细小、灰白色、扁平、半透明的菌落，周围有草绿色溶血环，其与甲型溶血性链球菌相似，培养23天后，因菌体发生自溶，菌落中央下陷呈“脐状”。（4）脑膜炎球菌：在巧克力（色）琼脂平板上加5%CO237培养24小时，形成圆形光滑隆起透明似露珠的菌落，无溶血环。 二、血浆凝固酶试验1、原理致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。2、方法及结果（1） 玻片法：取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，其中一格加2接种环的生理盐水，另一格加1：2人血浆（或免血浆）1接种环。用接种环取上次培养物葡萄球菌之菌落少许在生理盐水内研磨成细菌悬液，然后取此悬液1环与血浆混匀。5分钟以内观察结果，若有凝块出现，即为阳性；若无凝块出现，则为阴性。（2） 试管法：按表24-1加入1：4血浆及葡萄球菌肉汤培养液。将各管置37水浴中，每隔30分钟观察一次结果。在3小时内，若第一管及第二管出现凝固，而第三管不出现凝固则为阳性。表24-1 血浆凝固酶试验（试管法）试管血浆（1：4）待检葡萄球菌肉汤培养物金黄色葡萄球菌肉汤培养物肉汤结果10.5ml0.5ml20.5ml0.5ml30.5ml0.5ml三、药物敏感性试验实验原理 治疗细菌感染的药物如磺胺类、异烟肼、抗生素等杀菌具有抑菌和杀菌作用，其作用机制主要是干扰细菌的代谢，阻碍和影响细菌细胞壁的合成、膜的通透性及核酸和蛋白质的生物合成，不同的细菌种类或菌株，对同一药物的敏感性不同，因此测定病原菌对抗菌类药物的敏感性，对于合理用药和提高临床疗效具有重要意义。本实验通过两种方法测定细菌对抗生素的敏感程序。 内容与方法一、纸片法1、密集接种法接种细菌：用无菌接种环挑取已培养好的金黄色葡萄球菌培养物少许，先在平板琼脂表面中央划一条线，垂直该线作平行密集划线，划满平板。再将平板转动90度，作平行密集划线，划满平板。2、用无菌注射针头挑取抗生素（青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素等）滤纸片，贴在平板琼脂表面。滤纸片之间距离应基本相等，一般每个平板贴四到五个滤纸片为宜。注意每次取滤纸片之前，针头须烧灼灭菌冷却。3、将平板置37温箱培养24小时后取出观察滤纸片周围的抑菌圈（见图201），用尺子测量其直径并对照细菌对抗生素敏感度判断表做出结果判断。二、试管法1、金黄色葡萄球菌菌液制备取金黄色葡萄球菌68小时肉汤培养物0.1ml加于2ml肉汤培养基中，置37温箱培养68小时后备用。2、方法（1）取10支无菌小试管标号后，除第一管外其它每管加入肉汤培养基1ml。（2）在第一、二管中各加入青霉素（50u/ml）溶液1ml，混匀。（3）从第二管中吸取1ml加入第三管中，混匀，然后依此法加样稀释至第九管，再从第九管中抽取1ml弃去。第十管不加青霉素作为对照管。（4）于每管中加入金黄色葡萄球菌菌液各0.1ml，混匀。（5）置37温箱培养24小时后观察结果，以培养基混浊程度来判断细菌对青霉素的敏感程度，最高稀释度的抗菌药物仍能抑制细菌生长者为最低抑菌浓度（MIC）可用单位/ml表示之。 常用药敏试验纸片判断标准与其相应的MIC近似值抗菌药物 纸 片 抑菌圈直径（毫米） 最低抑菌浓度（微克/毫升） 含药量 耐药 中度敏感 敏感 耐药 敏感 青霉素葡萄球菌 10单位 20 21-28 29 0.20.1 其它细菌 10单位 1112-2122321.5链 霉 素 10微克 1112-1415 156氯 霉 素 30微克 1213-17182512.5 红 霉 素 15微克 1314-171882庆 大 霉 素 10微克 1213-141584卡 那 霉 素 30微克 1314-1718256四 环 素 30微克 1415-1819124多 粘 菌 素 300单位 89-111250单位磺 胺 300微克 1213-1617350 100 甲氧苯青霉素 5微克 910-1314-3萘 啶 酸 30微克 1314-1819 3212实验报告：记录血浆凝固酶试验结果；记录药敏实验结果。 结合系列实验结果，对病原性球菌鉴定作出结论。实验八 肠道杆菌的鉴定（一） 肠道杆菌是一群寄居于人或动物的肠道内的细菌，多数为非致病菌或条件致病菌，少数为致病菌。其生物学性状相似，但生化反应、抗原构造有差异，据此可将它们分类、鉴定。实验目的：1熟悉肠道杆菌未知标本分离和鉴定方法；2掌握肥达式反应的原理及结果分析，熟悉其操作过程；3了解大肠杆菌、痢疾杆菌及伤寒杆菌革兰氏染色形态示教片4了解肠道杆菌常见的一些生化反应及其在鉴定上意义、实验材料：1. 大肠杆菌或痢疾杆菌或伤寒杆菌革兰氏染色形态示教片2. 大肠杆菌、痢疾杆菌（或伤寒杆菌）在SS培养基上的培养物（示教）；3. 大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒甲或乙等在双糖铁培养基上的 培养物（示教）；4. 大肠杆菌与痢疾杆菌（或伤寒杆菌）的混合菌液（模拟粪便标本）；5. 痢疾杆菌及伤寒杆菌诊断血清，生理盐水，玻片；6. 诊断用肥达式菌液、肥达式平板、小试管、吸管、无菌滴管、伤寒患者血清（经5630分钟灭活）、水浴箱等；7. 单糖发酵管、蛋白胨水培养基、醋酸铅培养基、葡萄球菌和绿脓杆菌在普通琼脂平板上的培养物。实验内容： 1肥达氏反应原理：人体感染伤寒杆菌或副伤寒杆菌后，能产生与这些细菌起特异性反应的抗体，这种抗体及其量可以用已知的抗原来测得。本实验用已知的伤寒杆菌H、0抗原和甲型、乙型副伤寒杆菌的H抗原与可疑病人血清做定量凝集试验，可测定患者血清中相应抗体的含量及其增减情况，以协助伤寒或副伤寒病的诊断。方法：）取一有20（5*4）孔的有机反应板2块，连续标号，每行分别标号110。）取中试管1支，加入3.9ml生理盐水，再换一支吸管，吸取患者血清0.1ml（经5630分钟灭活）放入中试管内，吸打混匀；（此时血清稀释度为1：40）。）吸取1：40的血清2ml，在每列的第一孔中各加入0.5ml。）在中试管余下2ml血清中，再加入2ml生理盐水，混匀（血清稀释度为1：80）。然后吸取此1：80的血清2ml，在每列第2管中各加入0.5ml。）按上述倍比稀释，并依次加入各管，直至每行第9管（见表7-1）。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10HOPAPB140 180 1160 1320 1640 11280 12560 15120 110240 （-） 表7-1 肥达氏反应的加样示意图）另取吸管1支，吸取生理盐水向每行第10管中各加入0.5ml（对照管）按10、9、81列的顺序，分别对第1行各孔加入0抗原1滴；第2行各孔加入H抗原1滴；同样对第3行各孔加甲型副伤寒（PA）H抗原1滴；第4行各孔加乙型副伤寒（PB）H抗原1滴。由于抗原（菌液）的加入量少，可忽略不计。 ）将各孔混匀，置37水浴箱中2小时，取出置室温过夜，次日观察，判断并分析结果。结果观察（见图7-1）：根据凝集反应的强弱，分别以“+、+、+、+”记录：+：液体清澈透明，菌体全部被凝成块，沉于管底。+：液体较透明，大部分菌体被凝集而沉于管底。+：液体稍透明，管底有少量凝集沉淀物。+：液体较混浊，可见极少量凝集物。-：液体混浊，细菌因重力下降于管底呈边缘光滑圆点（与对照管相似）。管底现象记录方式图7-1 肥达氏反应的结果判定血清效价（或滴度）：能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“+”凝集）的血清最高稀释倍数，称为血清的效价。血清的效价代表着血清中抗体的含量，其效价愈高，所含抗体的量愈多。如血清最低稀释倍数（140）仍无凝集，则视为阴性或效价低于140；如血清的最高稀释倍数（11280）仍完全凝集，则示血清效价高于11280。结果分析：）首先应考虑当地正常人效价（正常效价）。一般以单份血清凝集效价：0效价应达1：80以上、H效价应在1：160以上，PA和PB应达1：40以上方有诊断价值；若病程中第2次血清效价比第1次高4倍以上亦有诊断价值。）由于H凝集素在血内保持时间较久，0凝集素较短暂，所以曾接种过伤寒、副伤寒菌苗者，0凝集效价在诊断上较重要。）真正的伤寒病人，0凝集素常较H凝集素出现早、但维持时间较短；H凝集素出现较晚、但效价较高且持续时间较长。）回忆反应：过去曾接种过伤寒、副伤寒菌苗或患过伤寒、副伤寒病，近期又发生感染如流感、肝炎、结核病等，可非特异地产生较高的H凝集素和较低的0凝集素，此现象称为回忆反应。）若0效价高而H不高（对正常效价而言），则可能是感染早期或与伤寒杆菌0抗原有交叉反应的其他沙门菌感染。）确诊为伤寒的患者中，约有10%的患者该试验始终阴性或效价不高，故阴性结果不能排除伤寒的诊断。）采血时间不同，肥达式反应的阳性率也不同。发病第1周约为50%；第2周80%；第4周90%以上。恢复期效价最高，以后逐渐下降，直至转阴。一般以双份血清（急性期和恢复期）对比，效价有明显上升者作为新近感染的指征。1. 观察大肠杆菌（或痢疾杆菌/伤寒杆菌）革兰氏染色形态示教片2. 肠道致病菌的分离鉴定（一）（1）介绍肠道致病菌的分离鉴定程序（图7-2）（2）分离培养与鉴定具体方法取材：挑取黏液脓血样粪便置清洁容器内立即送检。若不能及时送检，应用甘油缓冲盐水保存。若无法获取粪便时，用肛拭子检查（用无菌棉拭子经生理盐水湿润后，插入肛门45cm处轻轻沿肛壁擦拭一圈后取出，放入含少量甘油缓冲盐水的无菌试管中送检。粪便标本或肛拭子可直接在SS琼脂平板上划线分离培养（常用三区划线法，详见实验五 细菌的分离与培养）。对血、骨髓、尿等标本可先做增菌培养，然后取增菌培养物在上述平板上划线分离，经37培养1824小时。 2SS平板分离培养（方法同前）三区划线时注意：无菌操作; 划线角度准确，轻而快; 分区合理； 接种环适时处理；培养基正确放置，作好标记.。血清学鉴定取可疑 菌落G染色镜检SS琼脂平板培养基其他生化鉴定双糖铁培养基半固体培养基粪便标本血清学鉴定取可疑 菌落G染色镜检SS琼脂平板培养基增菌培养血、骨髓、尿其他生化鉴定双糖铁培养基半固体培养基粪便标本图7-2 肠道致病菌的分离鉴定程序附. 有关培养基及试剂的配制：（1）肉汤培养基：新鲜肉浸液1000ml、蛋白胨10mg、氯化钠5g，上述各成分混合后调PH7.27.4，分装于100ml疫瓶中，每瓶50ml，高压灭菌后备用。该培养基适合于各类细菌的增菌培养。（2）SS琼脂平板：牛肉膏5g、蛋白胨5g、乳糖10g、胆盐8.5g、枸橼酸钠8.5g、硫代硫酸钠8.5g、琼脂20g、枸橼酸铁1g、0.1%煌绿溶液0.33ml、1%中性红溶液2.5ml、蒸馏水1000ml。除了煌绿、中性红以外，将其它各成分混合于蒸馏水中，加热溶化，调PH至7.0，再加入煌绿和中性红，分装于三角烧瓶中，以68.95kPa高压灭菌10分钟，待冷至50左右，倾注于无菌平板中，冷后备用。适合于粪便标本中肠道致病菌的分离。实验报告：1. 观察示教片并绘图。2记录肠道杆菌的分离鉴定程序。 3. 记录肥达氏反应的结果，并判断效价和作出分析。实验九 肠道杆菌的鉴定（二）实验内容： 1. 观察上次实验结果在SS平板上的23区可看见散在的沿划线分布的大小不同、两种颜色的菌落。一种是较大的红色菌落，另一种是较小的半透明的淡黄色或无色的菌落。较大的红色菌落是肠道致病菌，较小的半透明的淡黄色或无色菌落是肠道致病菌。详见表8-1。表8-1 大肠杆菌、痢疾杆菌和伤寒杆菌的生物学特征特性菌名形态、排列及染色性在SS平板上的菌落表现生化反应动力吲哚乳糖葡萄糖H2S大肠杆菌杆状，散在排列，G菌落较大，不透明，呈红色+痢疾杆菌同上菌落小，半透明，无色或淡黄色+/伤寒杆菌同上菌落较小，半透明，无色或淡黄色+/+注：产酸产气，“+”产酸或阳性，“”阴性 2双糖铁培养基的接种从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，可先做革兰氏染色镜检，然后再接种于双糖铁培养基中（为观察比较，同组四人应取大小或颜色不同的两个菌落分别接种于两支双糖铁，并作好标记）。方法：（即实验五介绍的半固体接种法和斜面接种法的结合）用接种针以无菌操作技术挑取标本，立即垂直插入培养基中心至接近管底处，再循原路退出到斜面上； 接种针自斜面最低处向上划一直线（要求通过试管培养基的中心点），然后再从斜面低处向上轻轻来回作蜿蜒划线；接种完毕，盖好试管塞。贴上标签纸。37培养1824小时，取出观察结果并分析（参照表8-1）附：双糖铁培养基：蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，葡萄糖1g，氯化钠5g，柠檬酸铁铵0.5g，硫代硫酸钠0.5g，琼脂1215g，4g/L酚红水溶液6ml，蒸馏水1000ml。除糖类和酚红外，其他各成分均加热溶解，矫正pH至7.47.6，再加入糖类和酚红水溶液，混匀，过滤分装，每管3ml，68.95kPa灭菌15min，取出后制成斜面，斜面和底层各占1/2。3半固体培养基的接种另从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，可先做革兰氏染色镜检,然后再接种于半固体培养基中（为观察比较，同组四人应取大小或颜色不同的两个菌落分别接种于两支半固体培养基，并作好标记）。方法：详见实验五细菌的分离和培养中的半固体接种法。 实验报告： 记录上次SS培养基中出现的结果（绘图）；实验十 肠道杆菌的鉴定（三）实验内容： 1. 观察双糖铁培养基上细菌的生化反应情况肠道致病菌： 斜面红色， 底层黄色 ，若形成硫化氢，培养基变黑。 肠道非致病菌： 斜面黄色， 底层黄色，可能有气泡。原理：培养基的指示剂为酚红，酸性时呈黄色，碱性时呈红色。发酵乳糖的细菌使斜面和底层均呈黄色，可有气泡产生；若只发酵葡萄糖，则因葡萄糖含量少，生成少量的酸可因接触空气而氧化挥发，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面呈红色，底层由于缺氧，细菌发酵葡萄糖生成酸类物质不氧化而保持黄色；如细菌分解蛋白质中的胱氨酸产生硫化氢，则与硫酸亚铁作用生成黑色的硫化亚铁沉淀，使培养基变黑。2.观察半固体培养基上的细菌生长现象若细菌沿穿刺线生长，穿刺线周围的培养基清晰，则细菌没有动力（即无鞭毛）；若细菌沿穿刺线向周围扩散生长，穿刺线周围的培养基呈云雾状混浊，表明细菌有动力（即有鞭毛）。结合革兰氏染色结果、SS平板的培养结果、双糖铁培养结果、半固体培养结果作出初步诊断。3. 血清学鉴定玻片凝集试验（鉴定菌种）目的 观察细菌在玻片上与其相应抗体结合所出现的细菌凝集现象，理解抗原抗体反应的特异性。原理 将已知细菌抗体与待测细菌混合，如果抗原与抗体相对应，则引起细菌凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断细菌种类。材料 1、 1：20痢疾杆菌免疫血清，1：20伤寒杆菌免疫血清。 2、 待检菌培养物。 3、 生理盐水、玻片、记号笔、接种环、酒精灯、消毒缸等。方法 1、 取洁净玻片1张，用记号笔划分三等份，如下图所示：2、 用接种环分别取生理盐水、1：20伤寒杆菌免疫血清、1：20痢疾杆菌免疫血清各3-4环按图示位置放在玻片上，注意在换取另一种血清时要烧灼接种环，以免混淆血清产生错误结果。3、 用接种环挑取少量待检菌加入玻片的生理盐水中，充分混匀，再挑取少量待检菌加人1:20伤寒免疫血清中混匀，同法挑取待检菌加入1：20痢疾杆菌免疫血清中，混匀。注意无菌操作。4、 轻摇动玻片，12分钟后观察NS 伤寒杆菌免疫血清 痢疾杆菌免疫血清+ + +待检菌 待检菌 待检菌结果观察阳性：液体变清，并有乳白色凝集块出现。阴性：液体仍然混浊，无凝集块出现。 -+（阴性）（阳性）记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器内，切勿任意放置或冲洗。注意 取细菌培养物时不宜过多，与免疫血清混合时，必须将细菌涂散、涂均匀，但不宜将面积涂得过大，以免很快干涸而影响结果观察。4. 细菌代谢产物的观察观察细菌在培养基中的生长情况，参照前表（肠道杆菌生物学性状）分析并作出初步鉴定，依照此结果，再用其他生化反应来作最后鉴定。（1）单糖发酵试验：原理：各种细菌含有不同的糖（醇）分解酶，分解糖（醇）的能力不同，代谢产物也不同，有的产酸、有的尚有气体形成。因此可协助鉴别细菌，尤其是肠道细菌；单糖发酵管的制备：将1.6%的溴甲酚紫水溶液1ml加入PH7.6的蛋白胨水1000ml中摇匀。每200ml为一份，分装到已标好葡、乳、麦、甘、蔗等字样的五个锥形瓶中。在五瓶液体中分别加入五种糖，糖的最终浓度为1%。将五种糖培养基分别装入已备有小倒管的试管中，每管约34ml。经68.95kPa高压灭菌15分钟后备用。方法与结果：用灭菌接种环分别取大肠杆菌和伤寒杆菌少许，分别接种于五种糖发酵管，经37培养1824小时，观察结果；.糖不分解，指示剂仍为紫色，记录方式（）；.糖分解（产酸不产气）指示剂变黄，小倒管中无气泡，记录方式（+）；. 糖分解（产酸且产气）指示剂变黄，小倒管中有气泡，记录方式（ ）（+） （ ）气泡 黄色单糖发酵试验（2）靛基质（吲哚）试验：原理：各种细菌分解氨基酸的能力不同，借此可鉴别菌种。有些细菌如大肠杆菌、变形杆菌等具有色氨酸分解酶，可分解蛋白胨中的色氨酸生成无色的吲哚即靛基质，当加入靛基质试剂（对二甲基氨基苯甲醛），形成玫瑰色吲哚，可用肉眼观察。蛋白胨水培养基的制备：将蛋白胨1g、NaCl0.5g加入蒸馏水100ml，调pH值为7.6，分装试管，每管约34ml。经68.95kPa高压灭菌15分钟后备用。 方法与结果：用灭菌接种环分别取大肠杆菌、伤寒杆菌少许接种于蛋白胨水培养基中，经37培养2448小时。取出培养物后，加入23滴乙醚，混匀静置（使无色吲哚和乙醚一并上升至液体表面），再沿管壁加入23滴靛基质试剂于培养物表面，在两者接触面上呈玫瑰红色为阳性，黄色为阴性。（3）硫化氢试验： 原理：有些细菌如变形杆菌、副乙型伤寒杆菌等能分解含硫氨基酸（胱氨酸等）生成硫化氢，如培养基中含有铅盐（如醋酸铅）或者铁盐（如硫酸亚铁），硫化氢可与之结合生成黑褐色的沉淀物。 醋酸铅培养基的制备：将醋酸铅0.5g、硫代硫酸钠0.25g等加入到500ml2%的肉汤琼脂中，调PH值为7.47.6, 分装试管，每管约34ml。经68.95kPa高压灭菌15分钟后备用。方法与结果：用灭菌接种针分别取大肠杆菌、变形杆菌少许穿刺接种于醋酸铅培养基中, 经37培养24小时。沿穿刺线部位呈现黑色为阳性，无黑色出现为阴性。（4）色素的产生：原理：有些细菌在代谢过程中，可合成不同颜色的色素，有利于细菌的鉴定。色素分为两类：脂溶性色素：仅菌落本身着色，培养基不染上颜色。水溶性色素：色素本身可溶解，渗透到周围的的培养基中。细菌的色素，在室温、有氧、含血清、牛乳等培养基中产生丰富。 方法：观察两种细菌的色素，其颜色、特性等。实验报告：1记录上次双糖铁培养基、半固体培养基接种的结果（绘图并分析）；2记录玻片凝集试验的结果（绘图并分析）；3结合肠道致病菌的系列检查结果作出最后鉴定。4. 记录细菌代谢产物的观察结果（绘图并简要分析）： 单糖发酵试验、硫化氢试验、吲哚试验。实验十一 厌氧性细菌厌氧性细菌是一大类专性厌氧，必须在无氧的环境下才能生长的细菌。一类是革兰氏染色阳性有芽胞的厌氧芽胞梭菌；另一类是无芽胞的革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性的球菌与杆菌。前者致病菌主要有破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、肉毒杆菌等；后者临床上以革兰氏阴性杆菌多见，尤其是脆弱类杆菌。实验目的：1. 掌握破伤风杆菌、产气荚膜杆菌的形态特点。2. 熟悉重要的厌氧菌的培养特性。3. 了解常用的厌氧培养方法。实验材料：1破伤风杆菌、产气荚膜杆菌的庖肉培养物。2产气荚膜杆菌的牛乳培养基培养物。3高层培养基中的破伤风杆菌、产气荚膜杆菌的培养物。4. 破伤风杆菌芽胞染色、产气荚膜杆菌荚膜染色示教片。实验内容：1. 破伤风杆菌、产气荚膜杆菌的形态特征 （1）破