肺炎链球菌研究现况及血清分型

肺炎链球菌研究现况及血清分型,邵祝军2013-3-20,传染病监测：流行病学+实验室,2,环境,传 播,监 测,人 群,健康人群,暴露未暴露,感染,未感染,病例,携带者,呼吸道传染病室,细菌学实验室工作内容,病原学：采样、运输、培养、分离、鉴定、分型、保存抗生素耐药性检测免疫学：血清学、免疫效果评价分子生物学测：PCR检测、分型、聚类、遗传变异、进化分析,肺炎链球菌（ Streptococcus pneumoniae),又名肺炎球菌(Pneumococcus)或肺炎双球菌。多成双或短链排列,革兰染色阳性肺炎球菌主要抗原： 荚膜多糖：致病的主要基础及血清分型依据，超 过90种血清型 ，仅少数血清型致病 菌体抗原：C多糖，可与C反应蛋白发生沉淀反应。 M蛋白：型特异性蛋白溶血（草绿溶血环）。Optochin敏感试验阳性。胆汁溶解试验：自溶酶，胆汁或脱氧胆酸盐可激活自溶酶，加速菌体自溶。胆汁溶解试验阳性。可与甲型溶血性链球菌区别。,肺炎球菌血清型,PCV7: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23FPHiD10: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7FPCV13:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, 3, 6A, 19A,91 different capsule types (serotypes).110F18B28A40211A18C28F41311B18F2941F411C19A3142511D19B32A436A11F19C32F446B12A19F33A456C12B2033B467A12F2133C47A7B1322A33D47F7C1422F33F487F15A23A34815B23B35A9A15C23F35B9L15F24A35C9N16A24B35F9V16F24F3610A17A25A3710B17F25F3810C18A2739,肺炎球菌的传播,广泛存在的并易于传播5-72%的健康成人和27-58%的健康儿童的鼻咽部携带1单种血清型可在鼻咽部长期存在肺炎球菌可通过频繁密切的接触在人与人之间传播1. Pneumococcal Disease. CDC. Pink Book Chapters (12th edition,2011).,健康人群,暴露未暴露,感染,未感染,病例,携带者,肺炎球菌的致病机理,细菌黏附和穿透粘膜,细菌血中生存,细菌穿过血脑屏障,Meningococcal Disease, Nancy E. Rosenstein,N Engl J Med, 2001,中耳炎、鼻窦炎、支气管炎,肺炎,菌血症/败血症,脑膜炎,疾病严重程度,X 1000,X 100,X 10,患病率,侵袭性,非侵袭性,肺炎链球菌感染性疾病,Annual incidence of meningitis in 2岁Pneumovax 23: 默克/默沙东Pneumo 23： 赛诺菲-巴斯德惠益康(23价)： 成都生物研究所肺炎球菌结合疫苗：用于5岁Prevenar： 辉瑞-惠氏Prevenar 13： 辉瑞-惠氏Synflorix ： 葛兰素史克,全球5岁以下儿童IPD病例肺炎球菌主要血清型分布,611个血清型引起70%的IPD病例。,1, 5, 6A, 6B, 14, 19F, 23F,Hope L. Johnson，Plos Medicine，2010,2岁儿童肺炎球菌病主要血清型分布,2岁5岁儿童肺炎球菌病主要血清型分布,14,6B,19F,23F,6A,5,18C,19A,1,9V,14,1,6B,18C,23F,19F,6A,5,4,9V,IPD病例肺炎球菌血清型构成具有地域性差异,Hausdorff WP et al. CID, 2000,亚洲儿童IPD病例,欧洲儿童和成人IPD病例,中国肺炎球菌病疾病现况,疾病负担数据有限或不系统发病数及发病率病例的地域、年龄分布特征血清型分布和构成 菌株耐药情况 目前使用疫苗的血清型别覆盖率 疫苗研发 模仿 跟风 抗生素耐药血清型变迁 6A 6B, 19F 19A,细菌性呼吸道传染病实验室常用技术,培养基、细菌的接种、分离培养细菌鉴定、血清分型耐药性检测PCR及Real time PCR 技术用于标本的病原学检测和血清分型细菌的分子分型,26,疾病症候群监测,27,未知病原,医院,病例调查实验室检查,不同“症候群疾病 ”病原体相互交错,28,“发热呼吸道”症候群“发热伴出疹”症候群“发热伴出血”症候群“腹泻”症候群“脑炎脑膜炎”症候群,流感麻疹流脑肺炎链球菌流感嗜血杆菌肺结核,种瓜得瓜，种豆得豆，种瓜亦可以得豆,？,医院是传染病监测的关键环节,病例诊断标本采集是核心（无菌操作，标本足量，应充分考虑到临床常规检测的标本量的需求）标本床前接种培养（培养皿或血培养瓶），应注意避免污染和干扰细菌培养标本登记、分装、保存分离菌株鉴定和结果判断（侵袭性和非侵袭性病例）结果反馈,29,细菌性呼吸道传染病标本采集,1、急性上呼吸道感染: 鼻/咽拭子2、肺炎1）鼻咽拭子/鼻咽抽吸物：2）尿液：3）痰液：4）血液：5）胸腔穿刺液：6）支气管肺泡灌洗液。3、脑膜炎 1）脑脊液 2）血液,30,肺 炎症状、体征 影像学诊断，应考虑疾病的进行性改变。病原微生物学诊断：呼吸道分泌物分离培养，受正常菌群影响侵袭性的采样，操作风险、接受程度影响。,鼻/咽拭子,31,血标本,足量血标本，床前接种血培养瓶 。成人：每次采样抽血10mL，5mL注入准备好的血培养瓶。 儿童：每次采血5mL，3mL注入准备好的血培养瓶 血培养瓶有细菌生长，转种培养皿。血清可进行PCR或Real time PCR检测或抗体检测。 建议：不建议用碘伏消毒瓶塞，如用碘伏消毒，应用酒精脱碘。用70%酒精消毒血培养瓶橡皮塞子，酒精作用1分钟；在血液注入血培养瓶之前，用无菌纱布或棉签清除橡皮塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。防止皮肤寄生菌或环境微生物引起的污染。芽孢杆菌属、棒状杆菌属、痤疮丙酸杆菌或凝固酶阴性的葡萄球菌、不动杆菌等的标本一般视为污染。,32,脑脊液标本,不增菌，直接接种培养皿可做快速检测（涂片染色、乳胶凝集检测）PCR及Real time PCR 检测,33,抗生素的使用与细菌培养（举例）,病例1，孙xx：2007年1月8日出生， 2007年10月31日发病，河北邢台宁晋县医院就诊，11月1日，转河北省儿童医院住院，诊断为细菌性脑膜炎。11月1日，采集血标本和脑脊液，采样前使用抗生素治疗。脑脊液乳胶凝集试验，脑脊液Real time PCR阳性，血液和脑脊液标本检出Hib。病例2，张xx：2007年4月11日出生，2007-12-23发病，河北石家庄赞皇县人民医院治疗，后转省儿童医院，诊断为细菌性脑膜炎。2007-12-25，采集血标本和脑脊液，采样前使用抗生素治疗。脑脊液乳胶凝集试验、脑脊液Real time PCR阳性，血液和脑脊液标本检出Hib。,34,培养基及接种培养,普通培养基（血平板、巧克力平板）选择性培养基,35,培养基质量控制,标本接种 菌落取菌环划线接种培养鼻咽拭子涂布培养基后，应取菌环划线接种,细菌鉴定,Gram染色,36,奥普托欣敏感性抑菌环14mm,胆汁溶解试验,触酶试验,生化鉴定,肺炎球菌,流感嗜血杆菌,血清分型（群）- 玻片凝集结果及判读,细菌与一种抗血清凝集，和生理盐水不凝集时，才能鉴定为该种血清型。 如果不能确定血清群，菌株为不可分群菌株（NG）或不可分型菌株（NT）。关于NG/NT菌株在生理盐水中凝集，无论与任何抗血清发生强反应，都应标记为自凝菌。在生理盐水中不自凝，和多种血清出现凝集，记为NG。在生理盐水中不自凝，不和任何一个血清凝集，记作NG。,分型血清质量控制,37,乳胶试剂盒,在待检标本上滴加乳胶悬液,混匀,轻摇反应,观察结果,滴加待检标本,乳胶凝集快速检测,细菌耐药性检测（1）,K-B纸片扩散法：花费最少，但是结果存在一定的不确定性，该方法可将检测的分离株分为敏感、中介、耐药或对某种抗生素的不敏感。然而，不能提供MIC值，及反映该菌株对抗生素的敏感性减弱趋势。,39,16mm,6mm,CLSI或CA-SFM标准进行比对（核对质控菌株的各项结果是否在质控范围内）,影响因素：MIC、接种菌量、细菌生长率、抗生素含量扩散性、平皿厚度、温度孵育时间,细菌耐药性检测（2）,梯度试纸条法：操作简单方便，连续梯度浓度，稳定性好，检测结果可表示为g/ml，是一种半定量的检测方法。价格较高，结果需要仔细判读,40,细菌耐药性检测（3）,41,MIC肉汤稀释法,MIC琼脂稀释法,可同时检测多株细菌，观察细菌生长状况制备平皿工作量大，抗生素要求精度高,Micrococcus letus ATCC 9341Penicillin G,7 0.25U 43mm8 0.13U 38mm9 0.06U 35mm10 0.03U 32mm11 0.015U 24mm12 0.0075U 16mm13 0.0038U 8mm Blank 0mm,7,11,10,9,8,12,13,Branco,Discs of 6 mm,CSF标本中抗生素浓度检测,Micrococcus letus ATCC 9341,1,4,3,2,Blank,5,6,CSF samples,15 uL/disc,CSF标本中抗生素浓度检测,病例定义永远不可能完美,44,高度敏感的病例定义包括很多其它疾病病例特异性降低更多的病例，工作量增大,高度特异的病例定义排除很多真实病例敏感性降低失去部分病例，工作量降低,敏感度 = 90/100 = 0.90 = 90%,假阴性率= 10/100 = 0.10 = 10%,特异度 = 80/100 = 0.80 = 80%,假阳性率 = 20/100 = 0.20 = 20%,病例定义传染病监测的基石,侵袭性肺炎球菌病例Invasive Pneumococcal Diseases, IPD,45,菌血症脑膜炎肺炎非侵袭性感染,肺炎链球菌鉴别流程图,46,肺炎链球菌鉴定试验,47,溶血,奥普托欣试验,荚膜肿胀,胆汁溶解,传统的基于荚膜的肺炎球菌血清分型（群）：多克隆/单克隆抗体,48,荚膜肿胀(金标准）,肺炎链球菌丹麦血清棋盘分型法,1. 菌株依赖性2. 成本高3. 技术操作要求较高4. 不同血清之间交叉反应5. 结果解释主观性,49,较高的敏感性、特异性，克服交叉反应。经济实用性：减少对传统血清分型的依赖高通量、方案可调整：一次实验可同时完成多个反应，高通量检测血清型，根据当地流行血清型进行组合非培养依赖性：直接从标本中检测肺链及血清型操作简单，结果判断科学客观新的特异的分型引物公布,type specific,Spn + control,19F 3 15B 18 10A 7F,Control for multiplexassay reaction 2,Sequential multiplex PCR deduction of pneumococcal serotypes. Pai et al 2006. JCM,PCR用于肺炎球菌分型,肺炎球菌PCR与Real time PCR 检测,目标基因包括：lytA基因（自溶素）ply基因（肺炎球菌溶血素）：检测上呼吸道标本时，易产生假阳性结果，一些非肺炎链球菌的-溶血链球菌，这些细菌通常为呼吸道的正常菌群，如Streptococcus mitis和Streptococcus oralis，这些细菌又是也含有ply基因。psaA基因 （肺炎球菌表面黏附素）。,50,肺炎链球菌是革兰氏阳性菌，使用溶菌酶和变溶菌素进行消化，有利于去除细胞壁中的含量较高的肽聚糖，之后进行消化裂解有助于提高DNA的含量。,基于非洲目前主要流行血清型的肺炎链球菌PCR血清分型方案*如果反应2中6A/6B/6C/6D PCR阳性，则开展第9项检测,基于美国目前主要流行血清型的肺炎链球菌PCR血清分型方案* 如果反应1中6A/6B/6C/6D PCR阳性，则开展第8项检测,肺炎链球菌血清型分型引物 (/ncidod/biotech/strep/pcr.htm).,Capsule: diverse polysaccharides 6A 2)-D-Gal-(13)-D-Glc-(13)-L-Rham-(13)-D-ribitol-(5-PO4- 6B 2)-D-Gal-(13)-D-Glc-(13)-L-Rham-(14)-D-ribitol-(5-PO4- 19A4)-D-NAcMannose-(14)-D-Glc-(13)-L-Rham-(1-PO4- 19F4)-D-NAcMannose-(14)-D-Glc-(12)-L-Rham-(1-PO4-Capsule Gene locusDiversity of Capsule90 capsule types by Quellung reaction (1995)Common types (6A, 6B, 14, 19A, 19F), u