常见化学发光技术

现代免疫分析技术及展望,湖北省临床检验中心黄 鹏,为什么要讲这个专题 ？ 目的是什么？ 想解决什么问题？,目前我省免疫分析技术在EQA检测方法上存在的主要问题 对所用仪器检测原理、所用检测方法不明确、不清晰。 方法编码填写错误，统计中出现分组不当等现象。,不适当的评价限及分组方法对能力验证/室间质评结果所造成的影响（以肿瘤标志物检测为例，适合内分泌检测）,一、湖北省肿瘤标志物能力验证/室间质评活动指定值（靶值）确定进程 自2007年始，依北京科临易检软件公司提供的室间质评软件，借鉴部临检中心对肿瘤标志物采用的相关评价方法，在指定值（靶值）确定上经历了如下进程：,二、不同类型检测试剂盒、仪器及实验检测方法分组统计结果间的比较,三、湖北省肿瘤标志物检测能力验证/室间质评活动指定值（靶值）确定的发展趋势,对现代免疫分析技术进行系统性回顾尤为必要,何为免疫分析法？ 利用抗原抗体特异性结合反应检测标本中各种微量物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。 特点：高特异性、高敏感性 随着标记技术的发展，现代免疫学技术发生了质的飞跃。,1941年，Coons等创立荧光素标记抗体技术； 1959年，美国学者Yalow和Berson建立了胰岛素的放射免疫分析技术； 1966年，美国和法国学者又同时报道建立了酶免疫测定技术； 20世纪70年代，出现了免疫浊度技术； 另一项重大突破是：1975年Kohler和Milstein建立的杂交瘤技术与单克隆抗体技术。,现代免疫分析主要包括： 荧光免疫、酶联免疫、免疫浊度、化学发光及流式细胞免疫等技术。 随着免疫标记技术、单克隆抗体技术、计算机技术的发展，实验室的免疫自动化成为现实。,免疫自动化使现代免疫检验具有： 准确、灵敏（可达10-17mol/L 以上） 快速（每小时可分析近200个测试） 高效（一份样品可同时检测数十个项目） 精密度（CV5%）、稳定等优点。 以下对现代免疫分析技术及仪器进行简单介绍。,一 、酶免疫分析（EIA） 利用酶催化底物，产生一系列生化反应，生成有色物的生物放大作用，提高抗原-抗体免疫反应的分析技术。 按是否需将已结合的和游离的酶标记物进行分离，可将酶免疫分析技术分为： 均相和异相EIA（大部分标记免疫测定均属异相EIA。) 均相：一般是指底物与催化剂同时存在于同一体系中，比如说：溶液。 异相：一般是指底物与催化剂之间存在相界面，比如：吸附、固载、键合于高分子树脂链、水-有机两相反应等。,EIA具有:特异、敏感的优点，最低检测限为mg/L 水平。,（一）酶联免疫吸附试验（ELISA） 1、待检标本（抗体或抗原）与酶标记抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体发生特异免疫反应； 2、反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合，与待检抗体或抗原量成一定比例； 3、加酶反应底物后，底物可在酶作用下出现颜色反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。,ELISA方法: 既特异又敏感。 应用此技术的自动化仪器设备包括： 罗氏公司: ES300、 Cobas Core（II） Bio-Rad 公司： CODA、EVOLIS,（二）微粒子酶免疫分析技术（MEIA） 反应最终形成微粒上包被的抗体-被测物-碱性磷酸酶标记的二抗夹心复合物，将其转移到玻璃纤维柱上，用缓冲液洗涤，再加入底物进行测定。 优点：灵敏度高、定量线性范围宽。 见于美国Abbott公司IMX与AXSYM全自动快速免疫分析系统。,（三） 酶促放大时间分辨荧光免疫分析（EATRF IA） 引入了时间分辨荧光免疫技术，有利于排除特异荧光的干扰，并经酶促信号放大，增强了测量的特异性。 见于美国 M D 公司（Molecular Devices Corporation）的SPECTRA max GEMINI XS。,二、 免疫浊度分析 利用可溶性抗原、抗体在特定的电解质溶液中特异结合，形成一定大小的不溶的免疫复合物，使反应液出现浊度。 当反应液中保持抗体过剩时，随抗原量增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出样品的含量。,免疫浊度测定方法包括：透射比浊法、散射比浊法。 浊度法的优点： 校正曲线稳定 简便快速 易于自动化 无放射性核素污染。,（一） 透射浊度法（Turbidimetry） 1、抗原抗体复合物，使介质浊度发生改变； 2、光线通过抗原抗体反应后的溶液，被复合物微粒吸收； 3、透射光被吸收的量（吸光度）与免疫复合物的量呈正相关； 4、测量透射光强度，与已知浓度的抗原对照，计算被检测溶液抗原的含量。 优点：合适的试剂，可在生化分析仪中作全自动分析。,（二） 散射浊度法（NepHelometry） 1、一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原抗体复合物微粒； 2、光线被微粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物大小、多少密切相关； 3、散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测物越多，形成的复合物越多，散射光强度越强； 4、仪器通过微电脑对测量数据自动分析处理，即可得知待测抗原的含量。 此原理研发的全自动分析系统有： Beckman-Coulter 公司：Array和Immage SIEMENS的 BN系列产品,三 、荧光免疫分析（FIA） 是抗原- 抗体结合反应与荧光物质发光分析相结合的免疫分析技术。 以双抗夹心法为例： 1、首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 2、除去未结合抗体，加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物； 3、洗涤除去未结合物，加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体-抗原-抗体复合物； 4、最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。,普通的荧光检测水平能达到ng/L至mg/L。 荧光免疫分析系统（FIA系统）的分析技术包括： 荧光偏振免疫分析（FPIA）； 荧光酶免疫分析（FEIA）； 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）。,（一） 荧光偏振免疫分析（FPIA） 荧光素标记的示踪物与分析物的复合体，经单一平面偏振光照射后，可发出单一平面的偏振荧光。 特点： 此荧光在特定偏振面的强度与复合体受激发时的转动速度成反比，而转动速度与分子量的大小成反比。,当荧光标记的示踪物与分析物的复合体结合后，分析物的复合体对相应大分子抗体进行竞争性结合，使游离的复合体增多； 而复合体转动速度较高，这样在特定偏振面上检测到的荧光强度较低，反之检测到的荧光强度就会较高。 检测在特定偏振面上的荧光强度的高低，得到待检血清中分析物的浓度。,优点：灵敏度高，线性范围广，有较好的精确度。 代表性仪器有：Abbott公司的IMX、AXSYM自动分析系统。,（二）荧光酶免疫分析（FEIA） 1、利用酶标记抗原（或抗体）与待检抗原（或抗体）反应； 2、借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定、高效的荧光物质； 3、通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。 代表性仪器为： 法国梅里埃公司的VIDAS全自动荧光酶免疫分析系统等。,（ 三） 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA） 镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，与时间分辨测定技术结合的技术。 1、镧系元素铕螯合物被激发后，产生的荧光寿命比一般的荧光长； 2、待短寿命的本底荧光衰退后再进行测量，以此降低样品和试剂的本底荧光干扰，提高了测定的精密度； 3、其灵敏度可高达10-18mol/L，且克服了放射性污染及发光免疫分析方法的稳定性差等缺点。,具有：高灵敏度、高特异性、高精密度、高稳定性、分析速度快等优点； 时间分辨荧光免疫分析仪具有： 兼容性，可用其他厂商的各种分析试剂盒 有良好的发展前景,此原理开发的自动分析仪器有： EG & G的 Auto DELFIA （Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescence ImmunoAssay）。,四、 化学发光免疫分析（CLIA）,（一）技术优点 灵敏度高：可达pg/L至ng/L； 检测速度快：几秒钟即可产生化学发光信号，有的情况下信号可持续几小时甚至超过一天； 操作简便 ； 试剂对人体无危害； 成为非放射性免疫分析技术中具有发展前景的方法之一。,（二）化学发光免疫分析技术的基本原理 该技术含免疫分析和化学发光分析两个系统。 免疫分析系统： 化学发光物质或酶作为标记物直接标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体反应形成抗原一抗体免疫复合物。,化学发光分析系统： 1、是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物； 2、化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态； 3、发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。 根据化学发光标记物与发光强度的关系，可利用标准曲线计算出被测物的含量。,（三）化学发光免疫分析法的类型 根据标记物的不同可分为： 1、化学发光免疫分析； 2、化学发光酶免疫分析；（CLEIA） 3、微粒子化学发光免疫分析（MCLIA）； 4、电化学发光免疫分析法； 5、增强化学发光（ECL）,（一） 化学发光免疫分析 是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。 常见的标记物主要为： 鲁米诺类化学发光剂。 吖啶酯类化学发光剂。,吖啶酯：标记抗体或抗原，以磁性微粒为固相载体，吖啶酯发光只需加氧化剂和pH纠正液，不需酶催化的免疫测定方法。 方法特点：很高的灵敏度，但发光时间集中在加入过氧化物或碱的短时间内，测量时间极短，必须严格掌握。 代表仪器有： SIEMENS公司的ACS180SE、ADVAI CENTAUR XPAbbott公司的ARCHITECT,吖啶酯用于化学发光免疫分析（CLIA） ，由于热稳定性不是很好，经研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。 在H2O2和OH一条件下，吖啶酯类化合物能迅速发光，量子产率很高，如吖啶芳香酯的量子产率可达0.05。 吖啶酯作为标记物，用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。,鲁米诺类物质的发光：为氧化反应发光。 在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。 酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、 Cu2+、 Co2+和它们的配合物。 早期主要用于无机物和有机生物小分子的测定，灵敏度因标记后发光强度降低而降低。,另发现：发光体系中加入某些酚类及其衍生物、胺类及其衍生物和苯基硼酸衍生物对体系的发光均有显著增强作用，发光强度可提高1000倍，并且“本底”发光显著降低，发光时间也得到延长。 这些增强剂的使用，使化学发光免疫分析在蛋白、核酸分析领域得到广泛的应用。,（二） 化学发光酶免疫分析（CLEIA） 1、应用酶标记抗原或抗体，待测样本与检测试剂进行免疫反应后，形成酶标记抗原-抗体复合物 2、其结合在复合物上的酶对发光底物体系发生催化作用，产生发光效应 3、通过测定发光强度信号分析被测抗原或抗体的含量。 4、经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。 此技术见于： Johnson & Johnson 公司的VITROS Eci Beckman公司的ACCESS与DPC 公司的IMMULITE2000,属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免分析完全相同。 以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。,目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP ）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。 HRP最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。 在化学发光酶免疫分析（CLEIA）中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2 ）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。 Kodak Am erliteTM 半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。,常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,luminol),或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼),是一类重要的发光试剂。 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行, 在过氧化物酶及活性氧过氧化阴离子,单线态氧,羟自由基,过氧化氢存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光,其波长为425nm。,传统的化学发光体系（HRP- H2O2 -LUMINOL）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。 后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长的时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。,碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。 碱性磷酸酶和1，2二氧环己烷衍生物构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的一类化学发光体系。 这类体系中具有代表性的是ALP-AMPPD发光体系。 在溶液中AMPPD的磷酸酯键很稳定，非酶催化的水解非常慢，在pHl2的0.05 molL碳酸钠缓冲溶液中，分解半衰期可达74年，几乎没有试剂本身的发光背景。 AMPPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物, 可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。,底物AMPPD 在碱性磷酸酶(ALP) 作用下, 磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AMPD (半寿期为230min) 此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态时产生470nm 的光, 可持续几十分钟。,ALP-AMPPD发光体系具有非常高的灵敏度，对标记物ALP的检测限达10-21 mol，是最灵敏的免疫测定方法之一。 对AMPPD加以改进，获得具有更好反应动力学和更高灵敏度的新一代产物： CSPD、CDP-Star 这些体系已广泛用于各种基因、病原体DNA的鉴定。,所用底物1，2二氧环己烷衍生物, 是一类很有前途的发光底物, 用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团金刚烷基。 其分子中发光基团为：芳香基团和酶作用的基团。 在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。,美国DPC 公司的Immulite 全自动酶放大发光免疫分析仪, 以碱性磷酸酶为标记物, 以金刚烷作发光底物, 测定灵敏度相当于10-21mol/mL的酶, 采用聚苯乙烯珠作载体,其检测水平已能达到10-12g/mL。,（三） 微粒子化学发光免疫分析（MCLIA） 应用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原或抗体，以磁性微粒为固相载体，用AMPPD （Dioxetanes）作为化学发光剂。 这种化学发光剂发光稳定、持续时间长，因此比闪烁发光容易控制。 代表系统有：Beckman公司的ACCESS。,（四） 电化学发光免疫分析（ECLIA） 1、采用电化学发光技术、生物素放大技术，以磁性微粒为固相载体； 2、用三联吡啶钌标记抗原或抗体， 用三丙胺为电子供体，在电极表面失去电子而被氧化，氧化的三丙胺失去一个H+ 而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物； 3、这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子的分析技术。,此法较为敏感而稳定，为测试技术中一项新技术。 以Roche 公司生产的ELECSYS 为代表。 由于采用链霉亲合素-生物素技术和电化学发光技术，灵敏度达到甚至超过放射免疫分析的水平 。,ECLIA的突出优点是： 标记分子小，可实现多标记，标记物非常稳定； 发光时间长，灵敏度高； 光信号线性好，动力学范围宽，超过6个数量级； 可重复测量，重现性好； 可实现多元检测和均相免疫分析； 快速，完成一个样品的分析通常只需18 min； 可实现全自动化。 目前已广泛应用于抗原、半抗原及抗体的免疫检测。,（五） 增强化学发光（ECL） 1、将生物素化的（Biotinylated）第一抗体通过亲合素（Streptavidin）包被于反应杯内表面上； 2、当待测物与之结合后，再加入用辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体； 3、加入一种特殊的催化剂与发光醇（Luminol）及其他试剂后，可使辣根过氧化物酶氧化发光醇的反应速度大大提高。 此技术见于： 美国Johnson & Johnson的VITROS Eci的全自动免疫分析仪。,五、 流式细胞分析 流式细胞分析是综合激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学多门学科的科学技术。,流式细胞仪的原理 1、采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 2、利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的