《测序技术FAQ》PPT课件.ppt

GSJuniorFAQBasicsofSystemandExperiements GSJunior仪器 GSJunior试剂 GSJunior数据处理器 GSJuniorSystem二代测序平台触手可得 7ft 8ft 实际又实用的选择 系统及计算机硬件试剂测序原理实验及应用 软件及生物信息竞争其他 系统及计算机硬件试剂测序原理实验及应用 完整的GSJunior系统主要包括些什么硬件及耗材 包括一台GSJunior测序仪 货号 5922160001GSJuniorComplete 配套电脑及显示器 HPZ400服务器 货号 5943329001及5943337001 GSJunior配套软件v2 5 货号 5996627001 以及装机时配套附件 GSJuniorInstallationKit 货号 5943345001 其中 包括 BDD装置 要于PTP板上样 悬滴PCR测序珠计数器 用于悬滴PCR后打破油包水体系后测序珠富集时的计数 BDD离心平衡板及BDD离心器适配装置 上样过程中需要进行离心 数据信号线 链接测序仪与电脑 废液瓶 收集测序废液 等 另外如果需要 可以订购IKATurrax用于形成悬滴PCR的油包水体系 主要原理是震荡分散 什么是IKATurrax 是为品牌IKA 型号为Turrax的试管分散机 将试管放置在主机上 通过转子转动 分散均质或混合的样本 在我们的实验中用于准备emPCR的油包水体系 此外 也可以利用GSFLXTitaniumMVemPCRKit Lib L 及GSFLXTitaniumMVemPCRKit Lib A 的试剂盒 同步准备8个GSJunior的emPCR体系 方便规模化操作 GSJunior和GSFLX 的异同有哪些 相同点 测序原理都是焦磷酸测序 测序试剂的化学性质相同 测序质量相当测序制备的基因组文库可以在两个平台上通用两者的应用领域相同 可以同样进行shotgun文库 pair end文库以及amplicon文库测序 不同点 测序运行周期短 GSJunior为10小时 GSFLX 为22小时 GSJunior单次运行费用低测序结果读长数量为GSFLX的1 10 GSJunior的典型读长为400bp GSFLX 典型读长为700bp GSJunior的测序重量在40Mb 70Mb GSFLX 在700到1Gb利用IKA设备 可以方便的建立emPCR体系 GSJunior的通量是多大 一般以E coli基因组为例 Shotgun文库测序 一次测序可获得35MB数据一般以350bp长扩增子文库为例 Amplicon扩增子测序 一次约可获得25Mb序列通常 一次测序 shotgun实验可以获得10万条序列 amplicon实验可以获得7万条序列 样本的CG比例会影响到最终获得的数据量 或高或低 取决于样本质量和实验过程 通量可以达到60Mb以上 GSJunior单个序列的读长是多少 平均读长约400碱基 典型读长约500碱基 最长可超过600碱基典型读长通常为读长正态分布图的最顶峰 Junior系统在装机时需要订购什么试剂 用于一次安装过程中需要清洗系统的试剂盒 TestFragmentRun的试剂盒 培训用的试剂盒 详见GSJunior的装机单及相关培训必配清单 V Org AS AS APPLICATION GS 05 Quotation QuotationTools 2011 GSJunior系统配套计算机是什么 它的作用是什么 推荐的计算机是HPZ400 我们的货号还包括3年的保修计算机用于控制GSJunior系统进行测序实验 日常维护 原始图像数据转换成序列并筛选质控 也可用于序列分析 序列分析也可以在独立的计算机上进行 Z400的内存以及CPU可以处理目标片段或基因组小于50Mb的序列比对 目标片段或基因组小于12Mb的序列拼接 系统及计算机硬件试剂测序原理实验及应用 GSJunior有哪些试剂盒 emPCR的试剂盒 GSJuniorTitaniumemPCRKit LibL GSJuniorTitaniumemPCRKit LibA 测序用的试剂盒 GSJuniorTitaniumSequencingKit 测序试剂GSJuniorTitaniumPicoTiterPlateKit PTP板GSJuniorControlBeadKit 阳性对照测序珠用于TestFragmentRun吸管更换的试剂盒 GSJuniorSipperMaintenanceKit 每次测序反应和维护清洗都需要定一套维护清洗 GSJuniorMaintenanceWashKit 彻底清洁流路系统 当发现流路有受到污染的可能或者有一段时间没有使用机器GSJuniorPreventationMaintenanceKit 每12个月或者100次测序更换一次滤网及流路的管道 GSJunior和GSFLX 公用哪些试剂盒 05608228001GSFLXTitaniumRapidLibraryPreparationKit 文库制备05619211001GSFLXTitaniumRapidLibraryMIDAdaptorsKit 多样本混合05463343001GSFLXTitaniumLibraryPairedEndAdaptors PairEnd文库制备05618436001GSFLXTitaniumMVemPCRKit Lib L 悬滴PCR反应05619149001GSFLXTitaniumMVemPCRKit Lib A 悬滴PCR反应05618487001GSTitaniumemPCRShakerAdaptersMV 悬滴PCR反应 系统及计算机硬件试剂测序原理实验及应用 什么是焦磷酸测序 依赖于检测产生于核苷酸掺入过程中释放的焦磷酸盐 焦磷酸测序 Pyrosequencing 主要步骤如下 第1步 1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合 然后加入酶混合物 包括DNAPolymerase ATPSulfurylase Luciferase和Apyrase 和底物混合物 包括APS 腺苷酰硫酸 和Luciferin 荧光素 第2步 向反应体系中加入1种dNTP 如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对 则会在DNA聚合酶的作用下 添加到测序引物的3 末端 同时释放出一个分子的焦磷酸 PPi 第3步 在ATP硫酸化酶的作用下 生成的PPi可以和APS结合形成ATP和硫酸根 在荧光素酶的催化下 生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素 同时产生可见光 通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰 峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比 第4步 反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在腺苷二磷酸酶的作用下发生降解 第5步 加入另一种dNTP 使第2 4步反应重复进行 根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息 什么是焦磷酸测序 荧光素酶 ATP硫酸化酶 焦磷酸 荧光素 氧化荧光素 可见光 GSJunior测序实验的主要步骤有哪些 主要步骤有Shotgun pair end amplicon文库制备文库连接到测序珠上悬滴PCR扩增 富集测序珠上机测序 GSJunior测序实验的主要步骤有哪些 emPCR PrepRun Sequencing Hands onTimeTotalTime 2h6h 2h2h 0h10h TotalHands onTimeTotalTime 4h18h 什么是单克隆测序 它的优势是什么 单克隆测序 文库中的每个片段 最终单独获得一个序列相比传统的Sanger测序方法中 如果为混合样本 需要克隆到细胞 挑取单克隆子再进行测序 现在的二代测序不需要进行进行挑取单克隆的实验 即获得每个片段的序列 此外即使是PCR产物即扩增子样本 也可以测出扩增产物中每个分子的序列 不会出现混合不可分辨的结果 系统及计算机硬件试剂测序原理实验及应用 AmpliconSequencing Pair EndSequencing ShotGunSequencing分别指什么 AmpliconSequencing即扩增子测序 对于PCR扩增产物进行测序 相对定向的文库 测序的长度主要取决于扩增子的长度 ShotGunSequencing即鸟枪法文库 通过片段化产生的随机文库 主要用基因组拼接 或者基因组重测序的研究 Pair EndSequencing即对应跨度两端序列的测序 即同时获得间隔一定跨度的两段序列 目前我们提供的跨度选择为3kb 8kb 12kb 20kb 这种测序主要用于序列拼接中确定两个大片段序列的相互位置和方向 什么是重测序以及定向测序 重测序是指对于已有基因组图谱或者序列模板的基因组或基因组片段 再次进行测序 一般通过mapping的方法即序列比对进行分析 常常用于DNA碱基变异 RNA转录子异构体等多样性研究与发现 相对应的是全新基因组测序拼接 主要对象是没有基因组草图的样本 定向测序是指对于研究感兴趣的基因组片段或者一些基因进行测序 相对于全基因组测序而言 更加有侧重 可以减少测序量 费用和时间 主要通过Amplicon测序方法 或者序列捕获后ShotGun测序方法进行 如何在一次Junior测序反应中多个不同样本进行测序 在文库制备的过程中 利用GSFLXTitaniumRapidLibraryMIDAdaptorsKit试剂盒 给每个样本连接上一段特定的序列 作为标签 在测序后通过分析标签序列 即可将不同样本的序列分开 试剂盒中提供12个标签序列我们提供最多132个样本的标签序列信息 可自行定购 GSJunior的主要客户有哪些特征 不是测序大户 但是需要进行测序实验测序项目较小 需要长读长的二代测序进行微生物基因组测序项目 宏基因组研究 利用扩增子或者序列捕获技术进行的小规模定向重测序项目扩增子测序的长度在350 450bp 最大可以到600bp的长度 多个扩增实验产物或者样本可以混合测序 总通量达每次运行10万条序列 二代测序项目启动资金小的实验室项目时间紧 要求周期短 需要快速反复变动实验设计的验证实验实验室要求可严格控制 同时又能方便获得二代测序技术 价格较低 什么是宏基因组研究 宏基因组即各种生态生物环境中全部微小生物遗传物质的总和 主要研究环境样品中的微生物群体基因组 通过功能基因筛选和测序来掌握微生物的多样性 种群结构 进化关系 功能活性 相互协作关系及与环境之间的关系 由于占环境中99 的微生物种群不能够或者很难在实验室环境下培养 宏基因组学使人类得以了解这些微生物群落的细节 从而成为热门的微生物研究方法 实验方法 环境样本DNA提取 进行16S或18S等区域扩增 再对扩增产物进行建库 测序 然后对所得的数据进行生物信息学分析 目标客户群包括 CDC CIQ 微生物制品公司 如疫苗生产QC 环境 生态学实验室 远洋研究 法医鉴证 微生物工业化生产 基础科研微生物研究院 室 什么是序列捕获技术 序列捕获就是从一个总的样本库中 将感兴趣的序列挑选出来 目前主要的方式是针对感兴趣的区域设计单链的寡核苷酸探针 将探针与样本中的单链目标序列进行杂交 再洗脱出这些被杂交的序列 类似基因芯片的概念 可以在固相芯片以及也液相芯片中进行 RocheNimbleGen提供该类产品 在使用该方法前 需要对感兴趣的区域设计PCR引物 分别进行扩增 可能要进行很多PCR实验 操作繁琐 时间长 利用探针的方法可以减少工作量和时间 序列捕获后测序可以获得大量序列中研究人员感兴趣的序列 可以聚焦研究资源 减少测序成本或者提高测序覆盖度 我们在GSJunior上推出了什么Assay 第一个是GTypeHLAHRandMRAssay 即中度分辨率或者高分辨率的进行HLA分型 HLA分型有两部份重要的应用其一是在骨髓或者器官移植中 判定供体与受体的HLA区段的相似度 以决定是否接受移植其二是研究个体HLA区段的基因差异 以追寻各种疾病发生的遗传机制 与HLA即MHC区段密切相关的疾病 自身免疫性疾病系统性红斑狼疮银屑病口眼干燥综合征类风湿性关节炎强直性脊柱炎硬皮病结节性多动脉炎Wegener肉芽肿病炎症性肠病 IBD 癌症宫颈癌鼻咽癌传染病疟疾HBVHCVHIV药物敏感性抗艾滋病药物Abacavircarbamizine 基于Junior平台的其它Assay 即将推出 鼓励你的客户根据自己的需求自行研发 多才多艺的Junior平台提供稳定 便捷的舞台 coming coming 软件及生物信息竞争其他 GSJunior配有什么软件 一共包括7张光盘 操作系统软件 Junior测序仪操作软件 数据分析软件包括GSMapper GSAssember AmpliconVariantAnalyzer AVA 这些与FLX 的软件是完全相同 所有分析都可以在配套电脑Z400上进行 但是如果需要 也可以将数据拷贝到别的电脑上分析 软件使用的教程可见 请先注册 GSJunior配有什么软件 GSJunior的数据质量如何 Cumulativeerroroflessthan1 Q20 at400bases第400个碱基的累计错误率小于1 即Q20是400bp 读长约400碱基 典型读长约500碱基 最长可超过600碱基 Q20中的20是指log10 2 即0 01 同样 Q30是0 001 以此类推 Q20是什么意思 累计错误率小于1 是一种测序质量的衡量标准 在测序反应中 当测序长度增加时错误率会提高 第一个碱基的发生错误的可能性最低 之后逐渐增高 当到达第n个碱基时 发生错误的可能性累计到一定程度 GSJunior的Q20在400bp 即其第400个碱基发生错误的可能性在1 这是一种统计学上概率事件的描述 另外一种常用的测序质量描述叫做Consensusaccuracy 是通过将基因组测序结果进行拼接后 和已知基因组序列进行对比 通过拼接准确度对测序数据的质量进行衡量 从上机测序开始到获得序列的时间有多长 测序时间少于10小时 数据分析时间2 3小时 可获得序列通常可安排过夜测序 次日清早进行分析 下午即可获得初步结果 各个分析软件的作用 所有软件均免费提供 并免费升级 利用附带的GSMapper软件 可以在配套的计算机上 将目标区域或基因组小于50M的序列 与参照基因组进行对比利用附带的GSAssembler软件 可以在配套的计算机上 将目标区域或基因组小于12Mb的序列 进行全新拼接扩增子测序可以获得单克隆序列 即样本中的每种序列都可以单独测出 而不会出现模棱两可的碱基或者不可分辨的序列 可以利用附带的GSAmpliconVariantAnalyzer AVA 软件 在配套的计算机上 将逐个分析样本中含有各种序列 分析变异及异构体 可以检出罕见变异 什么是SequencingDepth及Coverage Depth是测序的深度 即序列中的一个核苷酸被重复测到的次数 用一个乘数表示 比如x20 Coverage是覆盖度 即目标序列有百分之多少被至少一次测到 用一个百分比表示 什么是Contig和Scaffold 这两个主要出现在对于拼接基因组结果的描述中 都指长片段的序列 Contig是通过相互重叠的单个测序序列相连而得Scaffold是通过额外的信息 包括限制性内切酶 Pair end的跨度信息 RNAtranscript等 将Contig连接出来的更大片段 Scaffold数量越接近染色体数量越好 即一个染色体对应一个scaffold最好 软件及生物信息竞争其他 GSJunior在市场上相对应的竞争产品有哪些 我们的优势是什么 不要单纯比拼参数 从整个测序项目上看长读长真正解决问题 长读长的用武之地 复杂的基因组植物 变化随机性强的基因环境微生物病原微生物 个体差异性大的基因区段HLAADME 病变差异大的基因区段恶性血液肿瘤HIV耐药 躲不开的重复序列 CGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTATAGCGATCTCGACATGCT RepetitiveDNASequence Shortreads 变化莫测的病原微生物 长读长一举覆盖多个可变区域 短读长往往无迹可寻 species1 species2 species3 mapuniquely mapeverywhere species1 species2 species3 whichone 流感嗜血杆菌共计有5000个基因 其中仅1400个在各个株之间是保守的 擂台赛之一 擂台赛之二 47contigs 960contigs 454三日内完成2011香港爆发的猩红热菌株测序 软件及生物信息竞争其他 如何