氧化应激损伤的生物化学诊断

广东医学院检验学院刘新光,第二十三章 氧化应激损伤的生物化学诊断,全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）,2,教学目标与要求,掌握：自由基、活性氧、氧化应激、歧化反应的概念及脂质过氧化作用。氧化应激指标的种类。 熟悉：氧化应激的损伤效应；主要活性氧、过氧化脂质、抗氧化酶、NO与NOS以及常用抗氧化剂的常用检测方法的原理及方法学评价。 了解：心肌缺血再灌注、衰老的概念；氧化应激的原因，抗氧化损伤的防御系统组成与作用。,3,目录,返回总目录,4,第一节 氧化应激的生物化学基础,一、氧化应激的概念,氧化应激（oxidative stress, OS）是指多种原因致使体内的活性氧(ROS ) 、活性氮(RNS ) 等相关物质产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致分子、细胞和机体的损伤。,5,活性氧(reactive oxygen species, ROS ) 如：超氧阴离子( O2 )、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、氢过氧化物（ROOH）,氧自由基（oxygen radical）,活性氮( reactive nitrogen species, RNS ) 如：一氧化氮（NO）、过氧亚硝酸根（ONOO）,6,(一)外源性因素1电离辐射及大气污染 和X射线等 ；2药物 解热镇痛药、抗结核药； 3其他 环境污染的镉、水银、铅等重金属离子 。,二、氧化应激产生的原因,7,(二)内源性因素,2OH的产生3吞噬细胞中活性氧的产生 4脂质过氧化作用,8,1. O2的产生,通过线粒体的辅酶Q半醌、内质网膜上细胞色素P450和Hb、肌红蛋白、肾上腺素等自氧化作用均可产生O2,9,黄嘌呤氧化酶,黄嘌呤2O2H2O 尿酸2O2 2H+,胞液中的黄嘌呤氧化酶与醛氧化酶 线粒体中的黄素蛋白酶 内质网中的NADPH-细胞色素P450还原酶 质膜上的NADPH氧化酶等,10,2OH的产生,主要是通过Fenton反应由O2 直接衍生形成：,11,过氧化物酶体中多种需氧脱氢酶催化生成的H2O2，如不迅速被分解，在Fe2+的催化下也可生OH。 H2O2Fe2+H+ OHH2OFe3+,12,3吞噬细胞中活性氧的产生,H2O2除可生成OH外，在Cl存在时，经髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的作用，生成活性很强的次氯酸(HOCl)和1O2，1O2是一个强的亲电子性的氧化剂。,OClH2O2 H2O1O2Cl,MPO,13,4脂质过氧化作用 (lipid peroxidation),在过氧化条件下，脂过氧化物 LOOH是不稳定的，能分解成一系列复杂产物。通常以小分子降解产物的数量来表示脂质过氧化的程度。,定义：机体产生的活性氧，攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)引发一种自由基链式反应，链式地产生脂质过氧化物，这种作用就称。,返回章目录,14,一、氧化应激对机体的生理作用,第二节 氧化应激的生物学效应,(一) 吞噬细胞杀灭外来病原微生物,吞噬作用所产生的活性氧如H2O2、O2 、OH、1O2和HOCl等可用来杀灭外来病原微生物。,15,(二) 参与合成某些重要的生物活性物质,参与第二信使cAMP和cGMP的激活等过程。,16,氨基酸的氧化脱氨作用需自由基的参与； 核糖核苷的还原过程需自由基的参与。,(三) 参与许多酶促反应,(四) 参与解毒作用,17,自由基参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，引起细胞损伤。其机制比较复杂，主要有三方面：膜脂改变导致膜功能的障碍和膜酶的损伤；脂质过氧化过程中生成的活性氧对酶和其他成分的损伤；LOOH的分解产物特别是醛类产物对细胞及其成分的毒性作用。,二、氧化应激对机体的损害效应,18,(一) 氧化应激对脂类和细胞膜的破坏,膜内不饱和脂肪酸减少；膜结构遭到破坏，使其流动性、通透性、离子转运及屏障功能受损；溶酶体酶释放，线粒粒膨胀、酶失活等损伤；红细胞膜破裂导致溶血；LOOH进一步分解产生醛类，尤其是丙二醛(MDA)可作为交联剂导致分子间的交联聚合。,胞膜的损害则会导致细胞代谢、功能和结构的改变，后者是许多疾病的病理基础，从而可引起许多病变。,19,(二) 氧化应激对蛋白质和酶的损害,直接作用于蛋白质（Pr） ，与最邻近的氨基酸（AA）发生Pr过氧化；通过LOOH间接作用于Pr，使多肽链断裂或与个别AA发生氧化或使Pr交联，从而使Pr的结构发生变化，导致细胞功能紊乱。,20,脂质过氧化、电离辐射、其他产生的自由基的反应 可通过多种途径影响酶活性: 通过自由基链反应，使酶分子发生聚合； 通过LOOH中的MDA使酶分子发生交联； 通过破坏酶分子中AA以及与酶分子中的金属离子反应。,21,使DNA链断裂或碱基破坏、缺失，使核酸分子的完整性和构型受到破坏，造成遗传信息改变；,(三) 氧化应激对核酸和染色体的损害,自由基对DNA的破坏可导致染色体变异；电离辐射和化学物质使受损细胞的染色体断裂。,22,(四) 氧化应激对糖分子的损害,使核糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，从而造成DNA主链断裂或碱基破坏；使细胞膜中的糖分子羟基化，破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞功能的发挥；通过氧化降解使多糖破坏，影响组织功能。,脂类、蛋白质、核酸、糖类一旦受损，生命活动将受到威胁，导致细胞受损，机体患病，如动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤、胃肠道功能失调、感染、免疫失调等。,返回章目录,23,一、抗氧化酶类,第三节 抗氧化应激损伤的防御系统,超氧化物歧化酶（SOD）过氧化氢酶（CAT）硒谷胱甘肽过氧化物酶（SeGSHPx）谷胱甘肽硫转移酶（GST）与抗氧化作用相关的其他酶（如醛酮还原酶）,24,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),SOD是金属酶，包括三种同工酶 CuZn-SOD 在真核细胞胞液中，以Cu2+-Zn2+为辅基 Mn-SOD 在原核和真核细胞的线粒体中，以Mn2+为辅基 Fe-SOD 在原核细胞中，以Fe3+为辅基,25,2. 过氧化氢酶(catalase, CAT),26,3. 硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium dependent glutathione peroxidase, SeGSHPx),还发现一新的硒酶：PHGSHPx ，称磷脂氢过氧化物谷胱甘 肽过氧化物酶，能清除生物膜上的磷脂氢过氧化物，防止生 物膜的脂质过氧化 PHGSHPx是单体酶 SeGSHPx是由4个相同亚基构成的寡聚酶,LOOH(H2O2)2GSH LOH(H2O)+H2OGSSG,SeGSHPx,可清除LOOH或H2O2，抑制自由基的生成,27,如醛酮还原酶，可催化脂肪醛和脂肪醛-谷胱甘肽加成物的还原，以清除脂质过氧化作用的毒性产物。,4谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase, GST) 属不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶，只清除 LOOH，而不能清除H2O2。,5与抗氧化作用相关的其他酶,28,脂溶性抗氧化剂水溶性小分子抗氧化剂 蛋白性抗氧化剂,二、抗氧化剂,29,1. 维生素E 清除O2、OH、脂过氧基 LOO及1O2，防止脂质过氧化。,3. 辅酶Q 既参与自由基的生成也具有抗氧化作用， CoQH2较氧化型的抗氧化作用强。,4. 固醇类激素 雌激素可能与结构中的酚基相关，但大剂量可生成O2 ，诱导肿瘤发生。,(一) 脂溶性抗氧化剂,30,VC还可与维生素E自由基 ( VE )反应，使其恢复为还原型维生素E，而本身变成VC，后者可由依赖于NADH的氧化还原酶系统还原成VC。VC与VE两者有协同作用。,因此VC的总效果与其浓度有关。,VC的不利作用：将Fe3+还原成Fe2+，H2O2存在时，可通过Fenton反应形成OH；但它又可清除OH。,(二) 水溶性小分子抗氧化剂,31,H2O22GSH GSSG2H2O LOOHGSH GSSGLOHH2O OHGSH H2OGS 2GS GSSG,4. 色氨酸代谢产物 3-羟犬尿酸，黄尿酸和3-羟邻氨基苯甲酸等均含有酚羟基，抑制脂质过氧化作用。,2. 谷胱甘肽(GSH) 为H2O2、LOOH、OH和1O2重要清除剂。,3. 尿酸 清除1O2和OH，抑制脂质过氧化。,32,1. 铜蓝蛋白具有亚铁氧化酶活性，能催化Fe2+氧化成Fe3+，抑制由Fe2+催化H2O2生成OH的反应，从而防止OH引发的脂质过氧化作用。,铜蓝蛋白还是吞噬细胞呼吸爆炸生成的氧代谢产物O2和OCl的主要清除剂。,(三) 蛋白性抗氧化剂,33,2. 清蛋白结合的胆红素 有效地清除1O2、O2 和LOO。,保护与清蛋白结合的不饱和脂肪酸和清蛋白本身 免受活性氧损伤。 肠道的抗氧化剂，保护维生素A和不饱和脂肪酸 免受氧化破坏。 胆红素在mol/L浓度时即能保护血浆蛋白免受 过氧亚硝酸致的氧化修饰，或通过清除自由基减轻 血浆蛋白损伤。,34,3. 其他血浆蛋白,清蛋白可结合铜离子抑制OH形成和有效清除OCl 。 结合珠蛋白和血液结合素(hemopexin)能与Hb结合， 促使Hb由受损组织和炎症局部排出，以减轻Hb对组织 的损伤作用。 转铁蛋白和乳铁蛋白，对铁催化的脂质过氧化作用是强 氧化剂。转铁蛋白还能清除OCl 。,上述抗氧化酶与抗氧化剂均属于机体的抗氧化防御系统,35,2. 二甲亚砜及甘露醇 两者均有清除OH的作用。二甲亚砜近来已用于抗脑水肿。,1. 别嘌呤醇 黄嘌呤氧化酶的抑制剂，能降低O2 的生成，是心肌缺血再灌注氧自由基抑制剂，但只有在灌注前用药，才能收到明显效果。,(四) 近年来发现的抗氧化剂,36,4. 白细胞功能抑制剂 前列环素(PGI2)是血管内皮细胞产生的花生四烯酸主要代谢物，能抑制血小板聚集，保护冠状动脉。它还能抑制中性粒细胞激活，减少自由基生成。,(四) 近年来发现的抗氧化剂,3. 钙拮抗剂 尼可地平、硝苯啶、维拉帕米和硫氮卓铜等有保护细胞和升高GSH的作用。,37,5. N-乙酰半胱氨酸 它本身是抗氧化剂，而且还是胞内合成GSH的原料。6. 普罗布可(Probucol) 是一种很强的脂溶性抗氧化剂或自由基清除剂, 该药有延缓泡沫细胞发生的的能力，可用于AS的辅助治疗。,(四) 近年来发现的抗氧化剂,返回章目录,38,一、氧化应激与心血管疾病,第四节 氧化应激与临床疾病的关系,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS) AS的发病机制尚未明了。脂肪浸润、血小板聚集、血栓形成和克隆等多种学说从不同角度阐明了其发病机制。近年来自由基与LOOH在AS发病机制中的作用受到普遍关注。高血压、高血脂、糖尿病、吸烟等易患因素均可增加细胞的脂质过氧化损伤，促进AS形成。,(一)氧化应激与动脉粥样硬化,39,自由基和LOOH可引起血管内皮细胞(EC)肿胀和破损，导致动脉硬化发生。LDL受到自由基作用，形成过氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)，大量沉积于EC，最终形成AS。Ox-LDL可导致血小板聚集，促使自由基大量产生，从而加速AS发展。,氧化应激与LOOH在AS发病机制中的作用：,40,近年研究进展：,AS的发生与OH和次氯酸致的蛋白氧化修饰存在相关性 AS病灶中EC、平滑肌细胞(SMC)及单核细胞的SiS基因表达 氧化应激刺激血管SMC的增殖，参与了原癌基因的激活及异常表达,从基因水平揭示:氧化应激与AS之间的密切关系,41,(二) 氧化应激与心肌缺血再灌注损伤,缺血再灌注损伤 在缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤反而加重的现象。,目前心肌缺血再灌注损伤的确切机制仍不明了, 与自由基作用有关的机制有:,脂质过氧化 细胞内钙超载 细胞成分间的交联 PGI2/TXA2失调, 微循环障碍,TXA2：血栓素A2（ thromboxane A2）,42,氧化应激致癌与促癌机制：,1. 氧化应激对DNA的作用 2. 氧化应激对蛋白质的作用3. 氧化应激对脂质的作用4. 基因损伤与致癌、促癌的关系,43,1. 氧化应激对DNA的作用,电离辐射可直接作用于DNA，产生自由基；电离辐射也可间接产生羟基DNA自由基；在有氧条件下DNA自由基与氧作用成为过氧由基；这些自由基是造成DNA链断裂的原因。,44,主要是修饰氨基酸残基，引起结构和构象的改变，造成肽键断裂，聚合和交联，造成细胞选择性生长和改变基因表达。,2. 氧化应激对蛋白质的作用,45,3. 氧化应激对脂质的作用,氧化应激不但可通过生物膜中的PUFA的过氧化引起细胞损伤，而且还可通过LOOH的分解产物引起细胞的损伤。,46,4. 基因损伤与致癌、促癌的关系,致癌物和促癌物均可造成基因损伤。 基因损伤主要为DNA单链或双链的断裂，重排 或碱基修饰。 化学致癌物的最终致癌形成包括某些自由基可 选择性作用于DNA的核苷酸而激活原癌基因。,47,它是生物体随着增龄而发生的退行性变化的总和，表现为机体功能活动的进行性下降，机体维持内环境恒定和对环境的适应能力逐渐降低。,人的生命周期中有一个随时间进展而表现出不断恶化，直到死亡的过程，老年医学将该过程称为衰老(aging 或 senscence)。,三 氧化应激与衰老,48,1956年 Harman的衰老的自由基学说：,机制：随着年龄增长，体内有大量过剩的自由基积累。,过多的自由基引发胞膜脂质氧化，其产物MDA造成细胞内核酸变性及功能障碍。 脂褐素(lipofuscin) 是衰老的基本特征 脂褐素的形成涉及脂质过氧化,体内过量的自由基及其所诱导的氧化反应长期使细胞受到损害，导致人体衰老和死亡。,49,1978年Zs-Nagy提出的衰老膜学说(the membrane hypothesis of aging, MHA),氧化应激诱导脂质和蛋白质交联以及质膜上所产生的残热可引起胞膜物理-化学特性的改变，且这种改变是通过随着年龄的增长而变化，从而使整个细胞产生退行性变化。,50,1972年Harman又提出线粒体衰老概念20世纪80年代Miquel和Fleming提出了“衰老的氧自由基线粒体损伤”的二阶段学说1990年Bandy等阐明线粒体DNA突变可增加线粒体内氧应激水平由此引发衰老的出现1992年Wallace等提出氧化磷酸水平下降与衰老和退行性病变，如阿尔茨海默氏病(AD, 亦称早老性痴呆)与帕金森病等有关。,返回章目录,51,第五节 氧化应激指标的检测方法及评价,一、主要活性氧的检测二、一氧化氮与一氧化氮合酶的测定三、抗氧化酶活性的检测四、常用抗氧化剂的测定五、氧化应激损伤的标志物检测,52,(二) OH检测 (三) H2O2的检测,一、主要活性氧的检测,53,NBT还原法高铁细胞色素C还原法羟胺氧化法较为常用,1. 物理检测方法,(一) O2 的检测,电子自旋共振(ESR)波谱分析法直接法 电子顺磁共振(EPR)波谱分析法间接法,优点：操作均较简单缺点：需昂贵的仪器，应用均受到限制,2. 化学检测方法间接法,54,具有设备简单，试剂便宜易购，操作简便，专一性好，结果较为准确等优点，适合于一般实验室的检测。,【方法学评价】,【注意事项】,55,(二) OH检测,原理是无荧光的对苯二甲酸与OH反应形成强荧光的羟-对苯二甲酸加成物，315nm激发，可发射425nm荧光，可检测受物理因素及化学因素处理后水溶液中产生的OH。,自旋捕捉法 气相色谱法(GC) 高效液相色谱(HPLC),优点：准确度较高 缺点：操作繁琐，仪器 昂贵，不便推广,优点：操作简便，测定快速，灵敏度 较高，稳定性较好。缺点：特异性不太高，需化学发光仪,分光光度法,荧光分析法,方法简便，易为一般实验室采用,化学发光法,56,【原理】利用H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的OH，使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，根据反应前后A536下降值进行计算。,分光光度法,溴邻苯三酚红光度法,【原理】利用H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的OH与溴邻苯三酚红形成有560nm处吸收峰的有色化合物，根据反应前后A560的升高值进行计算。,邻二氮菲-Fe2+氧化法,细胞色素C氧化法 水杨酸比色法,这两种方法稳定性好、操作简便、测定快速。,57,(三) H2O2的检测,碘滴定法分光光度法化学发光法荧光法通过测定CAT和过氧化物酶的活性也可估测H2O2的水平,H2O2是最稳定的活性氧,检测方法:,58,1. 分光光度法,过氧化物酶-氧化酶法Fe2+-邻二氮菲分光光法,碘化钾比色法,59,碘化钾比色法,快速、简便、重复性好，适合于溶液中mol/L水平的日常测定。,【原理】,H2O2+KI,I2,蓝色化合物,【方法学评价】,60,过氧化物酶-氧化酶法,经典的比色法，整个反应过程约20min，是一种操作简便、灵敏度较高(可达10-9mol/L水平)的方法。,【原理】,在弱酸性环境下，过氧化物酶-氧化酶反应中的NADH往往被完全消耗。 而在较高pH值环境下，NADH至少在反应的开始阶段并不完全被消耗，测定A340下降值, 计算NADH被消耗量。,【方法学评价】,61,2. NADPH氧化法,两方法灵敏度均较高。 前者无需制作H2O2的校正曲线，操作简便， 适用于大批量样品的同时测定。 后者适用于生物反应体系中微量H2O2测定。,【原理】测定体系中NADPH的氧化与H2O2的含量成正比,GSH-NADPH氧化法 Scopoletin-NADPH氧化法,【方法学评价】,62,二、一氧化氮与一氧化氮合酶的测定,(一) 一氧化氮(NO)测定,NO含量少，且极不稳定, 较难直接测定其含量。常用测定NO含量的方法多利用NO的化学性质，测定其终末产物NO3和(或)NO2的含量来反映组织细胞NO的含量。,物理方法有微电极法和EPR法，优点是灵敏度较高，可实时检测，但需昂贵仪器限制了应用。化学方法有Griess试剂法、硝酸盐还原酶法、荧光分光光度法、催化光度法、化学发光法，其中以Griess试剂法最为常用。,63,1. Griess试剂法：,A550与NO2或NO的产量成正比，据此测定,NO2 +对氨基苯磺酸 重氮化合物,pH7.58.1,重氮化合物+N-(1-萘基)-乙二胺 紫红色产物,偶联,550nm,本法稍加修改即可用于测定样品中的总硝酸盐含量(NO3与NO2浓度之和)。,(一) 一氧化氮(NO)测定,64,加合物+N-(1-萘基)-乙二胺 Griess反应,测A550nm，即可求出NO2 测NO3时可将其先还原成NO2，再测。 因血清中NO3NO2，NO2很低，因而测定结果主要反映血清中NO3的含量。,65,无需特殊的设备和昂贵试剂，操作简便迅速，在一般实验室、 均可开展，是目前使用最普遍的方法，适用于大批 量样品测定。 本法测的是NO2含量, 属于间接测定NO量，其特异性较差。 NO的还原可采用铜离子活化镉还原法或硝酸盐还原酶法。,【方法学评价】,66,测定光子量，可代表组织细胞NO的含量。可用NO气体制作校正曲线，直接测定样品中的NO。,2. 化学发光法,通过酸化或/和加入还原剂，使样品中的亚硝酸盐释放NO,NO+O3 激发态NO2* 发光,返回基态,样品用量较少，灵敏度较高，测定范围50250pmol NaNO2易受样品中其他因素的干扰，测定的NO含量并不完全代表组织细胞实际的NO量。,【方法学评价】,67,一般的Griess法仅测定NO2或NO3的含量，且Pr的NO衍生物均被脱蛋白的步骤除去。本法基于所有NO相关复合物均可被热裂解为硝酸盐。血浆Pr可通过热变性而除去，避免其干扰。,3. 全血NO代谢产物的测定,血液中NO代谢产物除NO3/NO2外，还包括S-亚硝基血红蛋白，亚硝酰血红蛋白等S-亚硝基/亚硝酰化合物，其总称为NO代谢产物。,68,激发波长365nm，发射波长426nm条件下测荧光强度,NO2+ 2，3-二氨基萘 1-(H)-萘三唑,H+,测定血中NO代谢产物总量，待测样品可为溶血或全血标本，测定结果可较全面反映NO代谢情况。其他方法因易受Hb或其他Pr影响，不宜用全血标本测定。,【方法学评价】,69,(二) NOS测定,1. 化学发光法 2. 血红蛋白法 3. NADP+检测法,70,1. 化学发光法,加入去铁乙胺可消除Hb对测定的干扰,71,2. 血红蛋白法,HbO2和MHb光谱特性有pH依赖性，pH7.7时：HbO2于401nm有最大光吸收MHb与HbO2混合液在411nm有等位光吸收峰测定A401和A411的变化可监测NO产量的变化， 反映NOS活性,NO+HbO2 MHb,72,3. NADP+检测法,测定NADP+在370nm激发波长下产生465nm发射波长的荧光强度，可反映样品中NOS活性。 NADP+的量可依靠酶催化循环扩增，可明显提高对NADP+检测灵敏度。,优势是可用于检测含有内源性Arg的粗制品缺点是NADP+的生成缺乏特异性,【方法学评价】,NO+L-瓜氨酸,NOS,73,三、抗氧化酶活性的检测,(一) 超氧化物歧化酶(SOD)测定(二) 谷胱甘肽过氧化物酶测定(三) 过氧化氢酶(CAT)测定,74,直接法一般化学法 化学发光法,(一) SOD测定,测酶活性,免疫学方法 测酶质量 电泳法,75,特异性强，所需样本量少(仅50l)，操作快速简单，重复性好，灵敏度高，试剂简单。,1. 一般化学法: 邻苯三酚自氧化法(改良Marklund法 ),在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm(经典为420nm),同时产生O2 ，SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量。,【方法学评价】,76,属间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。,1. 一般化学法: 细胞色素C还原法(McCord法),【方法学评价】,黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2 使细胞色素C氧化型还原为还原型，后者在550nm有最大光吸收。,将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中SOD活性。,在SOD存在时，一部分O2 被SOD催化而歧化，O2 还原细胞色素C的反应速度则相应减少。,77,2. 化学发光法,可应用于SOD的微量测定灵敏度高，简便易行特异性准确性与细胞色素C还原法类似,黄嘌呤或次黄嘌呤 尿酸+O2,黄嘌呤氧化酶,O,【方法学评价】,78,4. 免疫学方法,测定SOD质量，特异性较好，是较理想的方法。 只能测定Ab相应的Ag，对于检测不同种类的 SOD，则须制备相应的特异性Ab，手续繁琐。,放射免疫法化学发光免疫分析法ELISA法,【方法学评价】,79,(二) 谷胱甘肽过氧化物酶测定,两者的区别在于其活性结构中是否含硒non-SeGSHPx只能催化除H2O2外的过氧化物还原SeGSHPx则可催化H2O2及其他过氧化物还原,谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)有两种,硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx) 非硒谷胱甘肽过氧化物酶(non-SeGSHPx),80,1. DTNB直接显色法 2. 酶偶联连续监测法 3. 荧光测定法,SeGSHPx的测定,81,1. DTNB直接显色法,测定该离子的浓度即可计算出GSH减少量，以此求得SeGSHPx活性。,LOOH(H2O2)2GSH LOH(H2O)+H2OGSSG,SeGSHPx,GSH 5，5 -二硫代双，2-硝基苯甲酸,黄色,(DTNB),5-硫代，2-硝基苯甲酸,残留的,82,2. 酶偶联连续监测法,LOOH(H2O2)2GSH LOH(H2O) H2O GSSG,SeGSHPx,GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+,GSH还原酶,特异性强、灵敏度高，适用酶含量不高的样品 GSH还原酶的成本高是本法缺点,【方法学评价】,340nm,83,源自GSH的荧光分析法2GSH + H2O2 GSSG +2H2O GSH + OPA 荧光复合物,3. 荧光测定法,随着反应的进行，GSH不断被消耗，经一定时间的酶反应后，中止反应。剩余的GSH与邻苯二甲醛(OPA)在一定pH条件下生成较特异性的荧光复合物。通过测定其荧光强度即可测定SeGSHPx活性。,84,(三) 过氧化氢酶(CAT)测定,1. 钼酸铵比色法2. 快速简便法 3. 改良比色法4. 化学发光法,85,1. 钼酸铵比色法,反应迅速达到平衡，至少稳定60min，生成的黄色化合物的A405取决于H2O2和钼酸铵的浓度。,+钼酸铵 黄色化合物,405nm,残留的,H2O2,测定波长为360nm，测定温度为25。,2. 快速简便法,86,3. 改良比色法,在波长570610nm进行比色测定铬酸醋酸钾的生成量，可反映H2O2的含量。,CAT,简便、快速、显色稳定、重复性好，不需特殊试剂及仪器设备，适用于一般实验室使用。,570610nm,+醋酸重铬酸钾 铬酸醋酸钾,【方法学评价】,87,4. 化学发光法,CAT可引起化学发光强度减弱，由此计算总CAT活性。,H2O2+鲁米诺+ Co2+ 发出强烈蓝光,88,四、常用抗氧化剂的测定,(三) 维生素C测定,(一) 还原型谷胱甘肽(GSH)测定,1改良比色法2荧光测定法 3HPLC法,(二) 维生素E测定,1荧光法 2HPLC-分光光度法 3HPLC-荧光分析法,1DNPH比色法2荧光分析法 3氧化酶法 4HPLC法,89,测A412，即可测定巯基,1. 改良比色法,本法适用于血红细胞GSH含量的测定，采血量及试剂用量较少，更适用于儿童。,DTNB+2GSH 2-硝基-5-巯基苯甲酸+GSSG,黄色,【方法学评价】,DTNB：5，5-二硫代双，2-硝基苯甲酸,(一) 还原型谷胱甘肽(GSH)测定,90,2. 荧光测定法,灵敏度大大高于分光光度法本法适用于测定血小板中GSH,邻苯二醛(OPT) +GSH GSH-OPT,【方法学评价】,在激发波长345nm及发射波长425nm条件下 测荧光，对GSH定量,91,3. HPLC法,本法样品用量少，测定结果准确，灵敏度高 GSH最低检出限为3ng。 缺点：需HPLC仪，在一般实验室较难完成。,邻苯二醛(OPT) +GSH GSH-OPT,【方法学评价】,HPLC可有效地用于分离样品液中的GSH 根据OPT荧光法检测GSH的原理，通过分离的GSH峰测定样品GSH。 荧光检测激发波长338nm，发射波长425nm。,92,(二) 维生素E测定,维生素E是一族维生素的总称，目前已知有7种常见的有、和4种,本法灵敏度较高，是测定维生素E的经典方法。,【方法学评价】,维生素E同系物的分子结构中存在相同的共轭双键体系，检测在激发波长296nm，发射波长340nm条件下的荧光，可对维生素E定量。,1. 荧光法,93,-生育酚于292nm有特异性光吸收 胡萝卜素于450nm有较大光吸收,2. HPLC-分光光度法,生物样品中-生育酚及胡萝卜素可经过HPLC法较好地分离开来，通过检测不同波长下的光吸收值可测定样品中的它们的含量。,94,HPLC分离样品中维生素E 维生素E在激发波长296nm下可发射340nm的荧光 根据测试对样品纯度要求选择不同的样品处理方法,3. HPLC-荧光分析法,HPLC法大大提高了分析的准确度，且能同时 分离和测定各种维生素E同系物。 缺点是仪器设备较昂贵，分析成本高, 不适 应于常规检测的要求。,【方法学评价】,95,1. 2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法,抗坏血酸 脱氢抗坏血酸,脱氢抗坏血酸+DNPH 2，4-二硝基苯腙,硫脲及硫酸铜,H+,520nm,本法测的是样品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸总量 如省去氧化步骤，样品稳定，则可测脱氢抗坏血酸含量,是分光光度法较为理想的方法之一特异性不高，其他碳氢化合物可干扰，加入硫脲可增加DNPH反应的特异性。,【方法学评价】,(三) 维生素C的测定,96,2. 荧光分析法,抗坏血酸 脱氢抗坏血酸,脱氢抗坏血酸+邻苯二胺 脱氢抗坏血酸对-氮杂萘,测定在激发波长350nm，发射波长430nm的荧光 本法测定的是抗坏血酸与脱氢抗坏血酸的总量,97,3. 氧化酶法,脱氢抗坏血酸+Fe3+2，4，6-三(2-吡啶基)-S-三嗪 生色物,593nm,优点是不必对生物样品进行过多的纯化处理，甚至不用脱蛋白样品中的脱氢抗坏血酸须用其他方法测定,【方法学评价】,98,4. HPLC法,最好的方法，先层析法将样品中的成分分离，再用柱后检测器检测。,HPLC-紫外分光光度法,(2) HPLC-电化学检测法,是此类方法中最为简单的一种,最为理想的测定生物样品中抗坏血酸含量的方法,返回章目录,99,（一）脂质过氧化标志物检测 （丙二醛、脂氢过氧化物）（二）蛋白质氧化损伤指标检测（三）DNA/RNA损伤检测,五、氧化应激损伤的标志物检测,100,1. 丙二醛(MDA)的测定TBA比色法,操作简便、重复性好，是最常见测定方法 本法的线性范围约在5.020mmol/L 本法回收率较低，约为60%80% 本反应缺乏特异性，测定结果以MDA的相对含量表示 影响因素较多,【方法学评价】,过氧化脂质中的MDA与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色化合物，在532nm处有极大吸收峰。,（一）脂质过氧化标志物检测,101,灵敏度高，最低检出限0.16mol/L 样品中的G、Ch、TG、Pr等均不干扰测定 操作较简便，结果准确，荧光稳定，不需特殊试剂， 经济方便。,【方法学评价】,MDA可充分与TBA形成荧光缩合物 荧光产物的最大激发波长为525nm,1. 丙二醛(MDA)的测定TBA荧光法,102,快速简便，特异性很高和灵敏度较高。易产生干扰，预先加入CAT除去体系中的H2O2，可防止测定过程引起的过氧化干扰。,2. 脂氢过氧化物(LOOH)的测定SeGSHPx法,【方法学评价】,LOO