环境中的农药残留及其分析检测

环境中的农药残留 及其分析检测,农药的使用是农业增产的重要因素。然而，施用后一部分农药会直接或间接残存于谷物、蔬菜、水果、畜产品、水产品中以及土壤和水体中。残留在食品中的农药会直接危害人的健康，而环境中的残留农药也会通过食物链富集，最终到达人体。随着社会经济的发展和人类生活质量的提高，农残检测引起了人们越来越多的关注，发展可靠、灵敏、快速、实用的农药残留快速检测技术是解决农残问题的前提。,环境中农药污染事故,农药污染事故有人畜急性中毒型、水生生物中毒型和农作物受害型等。人畜急性中毒事故中，杀虫剂约占80%，其中又以高度有机磷农药为主，占90%以上；水生生物中毒事故的主要农药类型是杀虫剂和除草剂；农作物受害事故主要发生在水稻、棉花、玉米、油菜、果树上，近80%由除草剂引起。发生作物受害事故的农药有除草剂、杀菌剂、杀螨剂及杀虫剂,一 农药的分类,生产中使用的农药按其用途可分为杀虫剂、除草剂、杀菌剂、植物生长调节剂、杀螨剂、杀鼠剂等，其中杀虫剂、除草剂和杀菌剂的品种和用量最多，最受人们关注。,杀虫剂,杀虫剂按其化学结构又可分为有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯类杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂等。其中有机氯杀虫剂由于致癌、致畸、致突变、高残留等缺点，已停止生产和使用。 有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂具有高效、品种多、应用范围广、药害轻、在环境中易降解等优点，在世界范围内被广泛应用。但其中很多品种都是高毒农药，易引起农药残留中毒，部分品种已经禁止生产和使用。 拟除虫菊酯也是一类能防治多种害虫的广谱杀虫剂，其杀虫能力比老一代杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类提高10-100倍，因其用量小、使用浓度低，故对人畜较安全，对环境的污染很小，有取代前三种农药的趋势。,除草剂,除草剂包括三嗪类除草剂、苯氧羧酸类除草剂、酰胺类除草剂、取代脲类除草剂等。其中三嗪类除草剂是传统除草剂之一，因其化学性质稳定，用量大，使用后在环境残留时间较长，生产和使用在日趋减少。苯氧羧酸类除草剂也是开发较早的除草剂种类，此类除草剂易溶于地表水中而扩散，导致大面积环境污染，某些代谢产物对人体的毒害较大，残留问题备受关注。酰胺类除草剂开发较晚，在除草剂中占有重要地位，其应用作物种类和使用面积均居除草剂前列。这类除草剂的极性也较大，长期使用会对周围环境造成污染。取代脲类除草剂是除草剂的较新品种，在土壤中残留期长，在正常用量下，可达几个月，甚至一年多，对后茬敏感作物可能造成药害。,杀菌剂,杀菌剂 用于防治由各种病原微生物引起的植物病害的一类农药，一般指杀真菌剂 。包括有机硫杀菌剂、有机磷杀菌剂、取代苯类杀菌剂、三唑类杀菌剂等。大多数杀菌剂的毒性较低，但使用后也会部分残留在植物体和环境中，进而威胁人类健康。,农产品中的主要农药残留检测标准,农药残留量是农产品质量安全的重要指标之一。 世界各国，特别是发达国家对农药残留问题高度重视，对各种农副产品中农药残留都规定了越来越严格的限量标准。出口企业更需关注各国对农药的管理措施和农药残留限量标准的变化。在国内，食品中农药最大残留限量国家标准已于2005年10月1日强制实施。同时，政府机构将加强食品中农药残留量的监控，农药残留超标或含有高度禁用农药的的产品将难以进入市场,国家粮食产品质量监督检验中心隶属于大连市产品质量监督检验所，属于国家级食品质量检验的权威技术机构，是依法设立的第三方产品质量检验机构，现兼任国家食品市场准入水产品专业技术委员会主任委员单位、农业部指定的绿色和无公害农产品检测机构、全国食品工业标准化技术委员会食品通用检测技术分技术委员会委员单位、各类食品的生产许可证发证单位，可以依据相关标准，对各种农产品、食品的农药进行检测。,环境中农药残留的控制及检测标准,我国综合环境标准中控制的农药种类很少，“污水综合排放标准” 中仅对有机磷农药的最高允许排放浓度进行了规定。“地表水环境质量标准” 中，控制的农药有有机氯、有机磷、百菌清、甲萘威、溴氰菊酯、阿特拉津。“土壤环境质量标准”GB15618-1995和“温室蔬菜产地环境质量评价标准” 仅控制六六六和滴滴涕，其他的环境标准很少控制农药。,在相当一段时间里，我国其他农药的排放没有被列入环境保护控制范围，也没有规定的检测方法，导致一旦目前常用的农药发生污染事故，无法检测，也没有执法、处置的依据2008年，我国颁布了杂环类农药工业水污染物排放标准（GB 21523-2008），这是环境介质中关于农药的第一个国家标准，该标准选择的6个农药品种分别是杀虫剂吡虫啉、氟虫腈，杀菌剂三唑酮、多菌灵，除草剂百草枯、莠去津。6种农药分别用6个方法分析，其中吡虫啉和百草枯分别用0.45m微孔膜过滤、液相色谱法分析，其余四种农药分别用不同的溶剂提取后、气相色谱法分析。,我国农产品中农药残留检测的局限,我国食品中农药最大残留限量标准中有136种农药，残留限量477个，其不足之一是限量标准与方法标准不配套，有20种农药没有给出检测方法。目前，我国国家标准和行业标准共有涉及178种农药在92种(类)食品和农产品中的807项最大残留限量标准。同时制定了500多种农药在食品和农产品中的残留检测方法国家标准和行业标准，以及农药残留采样方法等其他配套的技术规范。与日本“肯定列表制度”所管理的食用农产品中农药和农药最大残留限量的数量分别为579种和51600多项相比，我国不仅控制的农药种类少，而且检测方法标准较为落后，如：样品前处理时间较长，许多检测方法标准仍然使用填充柱分离而非高效灵敏的毛细管技术，没有纳入先进的气相色谱/质谱联用和高效液相色谱/质谱联用检测技术等。,二 农药残留检测方法及发展趋势,通常情况下，不同基体中的农残需经提取、浓缩、净化后再进行分析。对于环境水样，液液萃取(LLE)、树脂吸附萃取、固相萃取和固相微萃取、膜萃取；对于土壤、农产品等固体样品的前处理，近年来主要有固相萃取、固相微萃取、超声波、超临界流体萃取、压力溶剂提取（或称加速溶剂萃取）、微波辅助萃取、超临界流体萃取方法、底物固相分散法、固相微萃取)、搅拌棒吸附萃取和液相微萃取等，其中固相微萃取方法、搅拌棒萃取方法和液相微萃取方法集采样、萃取、浓缩、进样于一体。,常用的样品浓缩方法主要有减压旋转蒸发法、KD浓缩法和氮气吹干法等。常用的净化方法主要有柱层析法、液液分配法、磺化法、低温冷冻法和吹蒸法、凝胶渗透色谱等。由于农药的活性成分大多是小分子有机化合物，故多使用薄层色谱法、气相色谱（根据农药特性，采用电子捕获检测器、火焰光度检测器、氮磷检测器等检测器）、高效液相色谱（紫外或荧光检测器）、气质联用（单级四级杆）、气相色谱串联三级四极杆质谱法和高效液相色谱-质谱联用等技术，除此之外分光光度法和毛细管电泳法也是常用的分析方法。近年来农药残留检测分析的新技术还有红外光谱分析技术、超临界流体色谱、柱切换高效液相技术、毛细管电泳和毛细管区带电泳、全二维气相色技术、气相色谱原子发射光谱联用技术等。除了色谱、光谱分析方法外，还有酶抑制法、免疫分析法、生物传感器法、活体检测法等生物检测方法。,有机磷农药,有机磷农药残留测定方法从检测方法上可分为色谱法、光谱法、生物化学法、免疫分析法、生物传感技术。目前应用于检测有机磷的色谱法主要有气相色谱法、气相色谱质谱法联用、高效液相色谱法、高效液相色谱质谱等；光谱法如分光光度法、气相色谱红外光谱联用；生物化学法根据对分解产物检测手段的不同，可分为酸碱指示剂法、速测卡法、薄层色谱法、分光光度计法、荧光法等。目前用于农药残留分析的免疫分析技术主要有放射免疫（RIA)和酶免疫分析（EIA)两种。EIA，尤其是酶联免疫吸附测定(ELISA)，已成为目前使用最广泛的免疫分析方法。根据生物活性物质不同，生物传感器可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器等。最常用的检测方法仍是气相色谱法，如用有机溶剂提取、液液分配步骤净化、用气相色谱/火焰光度检测器/检测了蔬菜样中有机磷类农药。,有机氯农药,有机氯农药多用气相色谱/电子捕获检测器(GC-ECD)检测，样品以丙酮-石油醚混合溶剂提取，固相萃取法(SPE)净化、富集，用石英毛细管柱、GC-ECD检测丹参中12种农药残留量。,拟除虫菊酯类,目前分析拟除虫菊酯类农药残留的主要方法是气相色谱法，所用检测器主要为电子捕获器(ECD)，也有用氮磷检测器(NPD)、火焰离子检测器(FID)的；高效液相色谱方法分析拟除虫菊酯类农药具有一定的优势，但其灵敏度没有气相色谱好；GC/MS具有GC的高分辨率和质谱的高灵敏度，是定性定量的有效工具。此外，液质联用色谱和免疫分析法的应用也在不断发展。 用正己烷：丙酮混合溶液作为提取液，经冷冻去脂，柱层析净化，可测定水产品中氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等拟除虫菊酯类农药残留。,农药的多残留测定,农药多残留测定是发展趋势。国际上农药多残留检测方法有很多，具有代表性的有：德国DFG法，可检测325种农药；S19法，可检测220种农药；美国FDA多残留检测法，可检测360种以上农药；荷兰卫生部多残留检测法，可检测200种农药、加拿大多残留检测法，可检测251种农药。我国从20世纪90年代初开始研究和利用多残留分析方法，并相继推出了一些国家标准。由于这些方法中使用的都是气相色谱仪的单个选择性检测器，因而都无法进行确证。,几种多残留分析方法,气相色谱-串联质谱(GC-MSMS)同时检测蔬菜中50种(38种有机磷、7种有机氮和5种拟除虫菊酯类)农药的多残留分析方法； 乙睛提取浓缩，加入乙二胺N丙基硅烷(PSA试剂)净化后，气相色谱-质谱法检测，选择离子峰面积定量，同时测定饲料中36种（有机磷、拟除虫菊酯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯等）农药残留量。 固相萃取高效液相色谱串联质谱(LCMSMS)同时测定蔬菜、水果中痕量21种农药残留量，这些农药品种涉及氨基甲酸酯类、杂环类化合物等。5大米中78种农药残留的检测方法。研究中采用乙酸乙酯提取样品，提取液经凝胶渗透色谱(GPC)净化、浓缩、定容后用气相色谱一质谱联用仪的选择离子模式进行定性，内标法定量。,三 农药快速检测法,传统的农药残留检测方法有比色法和容量法等，存在选择性差、灵敏度低等缺陷；近年来发展较快的仪器分析方法有毛细管电泳、毛细管气相色谱、液相色谱质谱等，这些方法能有效准确地测定样品中农残含量，但往往需要昂贵的仪器，需要专业人员操作，费时费力，不适合现场实时快速检测,国内外均先后发展了一些简单实用的农残快速检测技术，其中国外在免疫快速检测、生物和电化学生物传感器技术等方面取得了较快进展，已经有用于农残检测的酶标试剂盒等相关实用化的产品系列。而国内这方面的研究正在起步，在“十五”国家“食品安全关键技术”重大科技专项中实施了“蔬菜中农药、硝酸盐、亚硝酸盐和重金属残留的快速低成本检测仪器和方法研究”，并已经取得阶段性进展，研制了FITT2001 型农药残毒快速检测仪，开发了有机磷农药残留双光路现场检测仪、FDFY-I 型亚硝酸盐速测仪器、FDFY-II 型硝酸盐快速检测仪和铅注射式快速分离器和农药、硝酸盐、亚硝酸盐、铅等残留系列速测试纸/卡等。,1 发光快速检测法,1.1 化学发光法 化学发光(CL)是在一些特殊的化学反应中吸收了反应所释放的化学能而处于电子激发态的反应中间体或反应产物由激发态回到基态时产生的一种光辐射。化学发光体系在农药特别是有机磷农药的检测方面得到较好的应用，先后发展了基于乙酰胆碱酶抑制、基于鲁米诺与过氧化氢反应的检测方法。王建宁对化学发光检测方法在农药分析中的应用做了较为详细的介绍，用FIA-CL 对敌敌畏和甲基对硫磷进行了测定，测定了敌敌畏的发光曲线，得到敌敌畏的检出限为0.008g/mL，甲基对硫磷的检出限为0.02g/mL。化学发光体系检测农残灵敏度高，一般检出限远低于环境最低限量指标，其主要不足为重现性较差，而且待测体系中杂质也会对结果产生较大影响。,1.2 生物发光法,在有关生命体系中，利用发光细菌对农残进行检测。发光细菌在正常的生活状态下，体内的荧光素在有氧参与时，经荧光酶的作用会产生荧光。当受到外界因素的影响，如受化合物的毒性作用时，发光减弱，减弱程度与毒物浓度呈线性相关关系。目前建立了一种用发光细菌快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法，分析发光菌对蔬菜中六种有机磷农药的响应情况，探讨了检测空心菜中甲胺磷农药残留的最佳参数，并在随后引入了流动注射分析体系，以明亮发光杆菌作为污染物毒性检测的指示生物，探讨了有机磷农药、酸、碱、酚等污染物对发光细菌的毒性作用，研究了相关参数对农药降解的影响。发光检测方法稳定、快速、简便、重现性较好，但发光细菌的获得存在一定的困难，使其应用受到了限制,2 酶抑制快速检测法,酶抑制法“快速检测”农药残留依据的是：有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫的中枢和周围神经系统中Ach-E 的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱酯酶的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，正常情况下，酶催化乙酰胆碱水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，如果样品中农药残留量较高时，酶的活性将被抑制，基质就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。目前基于酶抑制法的原理检测农药残留的主要技术有酶片、酶膜生物传感器、试剂盒快速以及检测仪等。美国1958 年就已研制出称之为酶片的商品来检测有机磷农药，灵敏度为0.110g/mL。酶抑制法最大的优点是操作简便、速度快和不需要昂贵的仪器，特别适合现场检测以及大批样品的筛选检测，易于推广普及。但是灵敏度偏低，重复性、回收率还有待提高。可用于控制含较高农药残毒的蔬菜上市，但酶抑制法的显色体系不稳定，随反应时间长短而有所差异，且检测限高，容易漏检，不能定性和定量，酶活性也易受外界干扰而影响检测结果。,3 免疫分析快速检测法,免疫分析法是一种以抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析的分析技术，免疫分析方法很多，能用于农残快速检测的主要有：荧光免疫测定技术、放射免疫测定技术以及酶免疫测定技术等。酶联免疫分析法的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫分析的结果，使测定具有极高的灵敏度，在应用中一般采用商品化的试剂盒进行测定，其特点是将抗原或抗体制成固相试剂，在与标本中抗原或抗体反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其它物质的分离，简化了操作步骤。酶联免疫技术的样品前处理简单，纯化步骤少，大样本分析时间短，既适合于实验室检测，又可用于现场筛选，具有分析速度快、经济、简便的特点，但抗体制备不易，而且不能完成多种农药同时检测，限制了该技术的应用。,农药残留单克隆抗体免疫分析法,农药残留单克隆抗体免疫分析法是将单克隆技术引入酶免疫分析中建立起来的方法，其实质还是利用抗体与抗原的特异性反应来检测农残含量，方法的核心是利用单克隆技术制备高特异性的抗体。Gonzlez-Martnez 等设计了可以测定有机氯农药毒死蜱的代谢产物的基于单克隆抗体技术的免疫传感器自动分析系统(图1)，对样品的检出限可以达到1g/L 级别以下；Antonio等利用单克隆酶免疫分析技术测定了黄瓜和草莓中的西维因等三种氨基甲酸酯类农药，并与传统的HPLC 技术进行了比较，相同条件下回收率较后者高，而且省去了样品净化步骤，省时省力。,单克隆抗体免疫分析有其独特的优势，杂交瘤技术的应用可以得到大量性质均一具有高特异性的单克隆抗体McAb，不易产生交叉反应，使检测具有较高的特异性，且不易被无关的抗体干扰，有较高的灵敏度。McAb 可以用于制备免疫分析试剂盒，可以使操作简便、快速；但其不足也是显而易见的，有些农药小分子不能制备出McAb，另外，从制备人工抗原到纯化获得McAb 周期长，操作也不够简单。,4 传感器快速检测法,生物传感器是由一种生物敏感膜和电化学转换器两部分紧密配合、对特定种类的化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置，其特点是集生物化学、生物工程、电化学、材料科学和微型制造技术于一体，是一个典型的多学科交叉产物。按其生物功能，可分为电位型和电流型酶传感器、免疫传感器、微生物传感器等。与传统技术相比，该技术更合适对环境中有害物质的快速检测。生物传感器技术具有微型化、响应速度快、样品用量少并