《现代生物学方法论》PPT课件.ppt

现代生物学方法论 吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室 核酸技术 盛永杰 核酸技术 用来研究核酸 DNA和RNA 的技术 纯化 定量 重量上的丰度 光谱定量数量上的绝对丰度 定量PCR高通量相对丰度 DNA芯片高通量绝对丰度 序列分析基因表达 SAGE 分子量大小 凝胶电泳 合成 从头合成 寡聚核苷酸的合成基因扩增 PCR反应 概述 其他核酸技术 测序基因的表达与克隆印记杂交 Southern与Northern 生物芯片荧光原位杂交启动子技术 SELEX技术 反义技术 RNAi技术 非编码RNA 核酸的生物信息学 概述 一 反义技术 反义技术的概念反义技术的分子机制反义核酸的设计及注意事项核酶脱氧核酶 1 1反义技术概述 antisensetechnology 反义技术是根据核酸杂交原理特异性抑制特定基因 mRNA 表达的一种生物技术 包括反义RNA 反义DNA 核酶以及脱氧核酶 1 1 1概念 1 1 2反义技术的主要应用方向 1通过抑制基因表达活性研究特定基因在生理 病理条件下的生物学功能 2研究和开发以疾病相关基因为靶的反义药物反义药物 利用反义技术研制的药物 以特异的基因为靶 并与之特异性互补结合的一段约20个核苷酸组成的人工合成的寡核苷酸 1998年FDA批准了第一个反义药物Vitravene 巨细胞病毒性视网膜炎 1 2反义技术分子机制的模型 1 仅由结合介导的机制反义核酸与特定的序列结合 从而抑制该RNA与蛋白 其他核酸或其他因子的相互作用 最终影响RNA的代谢与功能 2 结合激活不稳定的机制 通过反义结合 影响RNA的稳定性 RNA加工 亚细胞定位和转运等 3 其他机制 1 2 1机制 1 2 2影响反义核酸生物学活性的因素 反义核酸浓度靶RNA浓度靶RNA代谢速率抑制机制的类型和效率等 1 2 3反义技术需要注意的问题反义核酸的纯度反义核酸的结构靶RNA结构反义核酸在组织和细胞内的转运和分布反义核酸与非核酸因子的结合及其影响不同抑制机制的作用 1 2 4能够有效起抑制作用的反义核苷酸特性 DNA序列的特异性和唯一性导入细胞的高效性无非特异性结合蛋白反义寡核苷酸mRNA特异形成杂交体靶蛋白或靶mRNA水平下降反义寡核苷酸无毒性反义寡核苷酸不引起炎症反应或免疫反应 1靶目标的选择尽量避免易突变区一般选择目标为起始密码子 AUG 或其附近的15 25个碱基序列 以及该靶mRNA的5 帽区 3 非翻译区2长度反义核苷酸一般是15 20bp长的单链 但是设计病毒和质粒载体可用较长的或全长DNA序列 3反义核苷酸的修饰4缺陷的避免避免回文结构以形成二聚体 GC含量不能太高避免产生高毒性和非特异性 GC含量高的序列可用硫代磷酸型寡聚体 1 3反义核苷酸设计原则 1 4核酶 Ribozyme catalyticRNA RNAenzyme RNAzyme 具有催化活性的RNA分子 1 4 1核酶的发现 1981年Cech发现四膜虫前体rRNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子 完成加工过程 1983年Altman在研究RNaseP时发现 该酶中的RNA分子单独完成前体tRNA加工 1989年Cech与Altman共同获得了诺贝尔化学奖 1 4 2核酶的分类 自身剪切类核酶 在自然界发现的自身剪切类核酶有锤头核酶 发夹核酶 肝炎 病毒 HDV 核酶 VS核酶 glmS核酶和CPEB3核酶 自身剪切类核酶共同特征 1分子小 一般为35 155个核苷酸 2剪切自身或异体RNA序列中的保守位点的磷酸二酯键 相当于内切核酸酶 产物带有5 OH和2 3 环状膦酸酯 3催化机制都是一般酸碱催化 质子的转移是共同的 4属于金属酶 催化反应都需要二价金属离子 锤头核酶 小分子自身分裂RNA 自身分裂是顺式 cis 反应 分子间分裂是反式 trans 反应 箭头指向切割位点 最小锤头核酶由三个结构域组成 1分裂结构域GUX X可以是A U C但不可以为G 2催化结构域 其中有13个核苷酸是保守的2底物结合结构域 二价金属阳离子 种类 离子强度 温度pH值 影响锤头核酶活性的主要因素 自身剪接类核酶 I类内含子 II类内含子 类 I类内含子 groupIlike intron GIR1分支核酶和剪接体 以及具有3 5 RNA连接酶活性的天然核酶 I类内含子的特征 长度140 4200nt 剪接位点序列为5 U G3 催化核心是保守的有内部的引导序列 IGS 通过转酯反应实现自身的剪接 需要辅因子 II类内含子特征 最大的核酶之一 长度为400 1000nt II类内含子不富含高度保守的序列 结构域V和结构域IV可读框除外 但是采用高度保守的二级结构 6个结构域围绕大的中心接合以特定的位置排列 RNP类核酶核糖核蛋白酶 ribonucleoproteinenzyme RNPzyme 由RNA和蛋白质成分组成的酶 分类 根据RNP酶中RNA和蛋白质分子对起结构与功能的贡献是不同 1RNP核酶 由一个催化RNA和多个蛋白质组成 RNaseP 剪接体和核糖体等 2RNP酶 催化作用依赖于蛋白质和RNA的密切合作 端粒酶 3RNP蛋白质酶 由结构RNA和蛋白质酶组成 信号识别颗粒SRP 核酶的应用 核酶在抗HIV中的应用核酶抗肝炎病毒的应用核酶在抗生殖道感染的应用核酶在抗白血病中的应用核酶在抗移植排斥反应中的应用 1 5脱氧核酶 Deoxyribozyme catalyticDNA DNAenzyme DNAzyme 单链DNA和单链RNA的区别1RNA中有2 OH DNA则没有2RNA中有尿嘧啶 U DNA则是5 甲基尿嘧啶 T 3糖环的折叠上 RNA的优势构象是C3 endo 而DNA的优势构象是C2 endo 1994年BreakerRR与JoyceGF通过体外筛选得到具有催化活性的DNA BreakerRR JoyceGF 与核酶相比 脱氧核酶具有明显的优势 1相对分子质量小 合成成本低 稳定性高 选择性强 不仅可以精确的切割或连接底物RNA DNA 而且可以催化更广泛的化学反应 2脱氧核酶具有与一般药物相似的动力学特点 作用程序和时间容易控制 脱氧核酶可以催化反应类型 切割RNA的脱氧核酶切割DNA的脱氧核酶聚核苷酸激酶活性的脱氧核酶连接酶活性的脱氧核酶催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶N 糖基化激酶活性的脱氧核酶 常见的几种脱氧核酶 10 23结构脱氧核酶8 17结构脱氧核酶手枪型脱氧核酶二分结构脱氧核酶 10 23结构脱氧核酶 1在模拟的生理条件 2mmol LMgCl2 150mmol LKCl pH7 5 37 以多转化率分裂靶RNA 2选择靶位点灵活 能够用任一靶RNA形成Watson Crick碱基配对 能够在任一嘌呤和嘧啶之间分裂RNA 影响10 23脱氧核酶活性的主要因素 活性中心核苷酸的组成二价金属阳离子 种类 离子强度 反义臂长度与核苷酸组成效应物分子的作用 8 17结构脱氧核酶 1原型酶只分裂底物5 A G 3 A不与脱氧核苷酸配对2靶部位的下游有 rG dT 摆动配对 脱氧核酶的应用脱氧核酶在基因治疗中的应用在抗肿瘤方面应用抗HIV病毒方面应用其它针对mRNA的应用在PCR技术上的应用作为分子生物学分析的工具 根据酶活性部位柔性的基本理论 考虑RNA柔性比DNA大 设计一个以锤头核酶为催化结构域和以DNA为骨架的环状RNA DNA酶 SchemeforconstructionofcircularRNA DNAenzyme 环状核酶的构建 以高活性 结构稳定的10 23DNAzyme为催化中心 以单链载体M13mp18为骨架构建了环状可复制的10 23DNAzyme 环状脱氧核酶的构建 以10 23DNAzyme hammerheadribozyme为催化中心 以单链载体pBluescriptIIKS 为骨架构建了复合酶DNAzyme RNAzyme 环状脱氧核酶 核酶复合酶的构建 核酶与脱氧核酶的转换 核酶与脱氧核酶的转换 双功能脱氧核酶的设计与构建 二RNA干涉 RNAinterference RNAi 2 1RNA干涉现象的发现 1990年 为加深矮牵牛花 petunias 的紫色 Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因 可是结果与预期相反 许多花瓣颜色并未加深 反而呈杂色甚至白色 这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了 Jorgensen把这个现象命名为共抑制 cosuppression 1995年 康奈尔大学的SuGuo在用反义RNA antisenseRNA 阻断线虫基因表达的试验中发现 反义RNA antisenseRNA 和正义RNA senseRNA 都阻断了基因的表达 1998年 AndrewFire等的研究证明 在正义RNA阻断了基因表达的试验中 真正起作用的是双链RNA 同时包含了正义链和反义链的双链RNA double strandedRNA dsRNA 阻断基因表达的效果要比单独注射正义链或者反义链强得多 1998年2月19日 自然 杂志 Nature Fire与Mello发现RNAi的实验 带有肌肉蛋白编码信息的RNA被注射到线虫 C elegans 体内 单链RNA没有产生任何效果 但当双链RNA注射之后 线虫开始抽搐 这是一种类似于携带有肌肉蛋白缺陷型基因的线虫所表现出的表型 2006年诺贝尔生理学或医学奖 AndrewZ Fire CraigC Mello 颁奖声明 获得者发现了一种可以针对特定基因降解其mRNA的方式 在这种RNA干涉现象中 双链RNA double strandedRNA 以一种非常明确的方式抑制了基因表达 植物 动物 人类都存在RNA干涉现象 RNA干涉对于基因表达的调控 对病毒感染的防护 控制跳跃基因具有重要的意义 dsRNA的分子调控分类 mRNA降解转录抑制翻译抑制染色体重构 2 2RNAi的分子机制 RNAi的分子机制 RNAi的分子机制 2 2 1dsRNA的产生 dsRNA来源 细胞内源性基因的双向表达具有反向重复结构的细胞内源性基因表达形成的发夹状RNA shRNA 转基因表达的mRNA异常聚合转座子转录RNA病毒基因组或病毒感染复制过程中的中间RNA产物实验方法通过质粒载体或病毒载体转染表达的dsRNA或shRNA 2 2 2起始阶段 dsRNA被Dicer酶加工成为siRNA Dicer酶 RnaseIII核糖核酸酶家族 能够在RNAi中能够有效将dsRNA降解为siRNA 进而诱导RNAi Dicer酶在进化上高度保守 Dicer酶以单体形式催化两个核酸内切反应 2 2 3中间阶段 RISC装载siRNA 2 2 3 1RNA诱导的沉默复合体RISC RNA inducedsilencingcomplex 2 2 3 2RISC的装载与起始阶段偶联 2 2 3 3RISC装载单链siRNA 如果双链的其中一端不稳定 那么这一段具有5 磷酸基团的单链更加倾向于与RISC进行装配 那么这条链会引导RISC寻找与之匹配的mRNA并进行切割 此条链称为引导链 guidestrand 另一条链称为过客链 passengerstrand 会被遗弃不用 影响siRNA链选择的两个因素 siRNA热力学稳定性 Dicer酶剪切方向 2 2 3 4RISC装载对ATP的依赖精简的RISC不需要ATP 完整的RISC需要ATP 2 2 4完成阶段 RISC剪切mRNA 处于活性状态的RISC装载有siRNA的引导链 接下来它将寻找识别与之匹配的mRNA 一旦mRNA与引导链之间有着充分的碱基互补配对 RISC将会对mRNA进行切割 这一过程与siRNA过客链的剪切过程类似 剪切位点的选择高度特异 通常位于从siRNA5 端数起的11到12个碱基位置 2 3siRNA分子靶位点的选择 靶基因中RNA干涉作用位点的选择遵循原则 1 从起始密码子寻找5 AA N19 TT序列 如果在靶基因中不存在这种序列 可以寻找5 AA N21 或5 NA N21 序列 2 如果需要抑制内源性靶基因的表达以后在表达该基因的突变体或含有标签的融合基因 则靶位点应该选择基因的5 或3 非编区 以便于后续的实验操作3 避开靶基因的内含子序列 因为RNAi主要发生在胞浆内 而未拼接的mRNA主要位于细胞核内4 选择GC含量比较低的序列作为siRNA 一般来说 G C含量为40 55 之间的siRNA比G C含量大于55 的siRNA更有效 此外富含G序列更容易在细胞中形成高级结构导致非特异性的反应 5 设计时最好找寻形成二级结构趋势较小的位点6 在进行RNA干涉实验室 针对每个靶基因至少要设计并分析4个siRNA分子并尽可能使这些siRNA位点沿着靶基因分布 一寻找有效的靶位点 提高实验的成功率7 确定靶位点后 应该通过BLAST检索确保选择的siRNA与其它基因没有明显的同源性 2 3siRNA分子靶位点的选择 化学合成siRNA 靶mRNA序列 5 aaguaucgaguucagcauuccuu 3 siRNA分子 5 guaucgaguucagcauuccuu 3 正义链3 uucauagcucaagucguaagg 5 反义链 siRNA分子的设计 合成时 可以用T代替U降低成本 提高siRNA分子的稳定性 体外转录合成siRNA 成本低 抑制效果明显优于化学合成实验室通常采用T7RNA聚合酶体外转录合成siRNA 采用RNA聚合酶III启动子表达siRNA分子 载体表达法PCR方法 采用RNAseIII制备siRNA分子 首先在体外以长为200 1000bp的cDNA为模板转录合成正义与反义的单链RNA分子 然后通过退火形成长的ds分子 再用Dicer核酸酶进行切割得到siRNA分子的混合物 通过纯化取出没有被切割的双链RNA分子和DNA模板 siRNA分子可以用于转染细胞 优点 不需要大量的合成并筛选有效的siRNA作用位点缺点 可能会产生非特异性的基因沉默 RNAi实验注意事项 1必须采取措施防止和消除RNase的污染 2在进行RNA干涉实验之前 应该考虑到靶基因产物的半衰期及其在细胞中的丰度和表达调控机制 RNAi不适合研究具有长半衰期的蛋白质在细胞中的功能 3RNAi不适合有些酶基因的功能研究 4用于转染细胞的siRNA分子的浓度同靶基因的特性和细胞类型有关 用于转染细胞的siRNA分子的浓度一般在30 100nmol L之间 5不同细胞的转染效率是不同的 对于不同的转染试剂和培养细胞需要通过预实验来确定转染条件 生长状况良好的细胞转染效率要比生长状况较差的细胞要高 6尽量采用传代次数较少的 一般采用传代次数在50代以内的细胞进行转染 7细胞密度对转染效率的影响 对贴壁细胞来说 最佳转染密度为30 70 8用适当的阳性siRNA对照优化转染和检测条件 看家基因是较合适的阳性对照 要有1 2个阴性对照来确定靶siRNA对靶基因抑制作用的特异性 9