免疫治疗2015

免疫治疗immunotherapy,郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室,免疫治疗的概念,针对机体低下或亢进的免疫功能，根据免疫学原理，利用物理、化学和生物学的收到人为地增强或抑制机体的免疫功能，达到治疗疾病目的的措施。,免疫治疗的类型,根据对机体免疫应答的影响分为：免疫增强疗法(immunostimulation therapy) 免疫抑制疗法(immunosuppression therapy),根据治疗特异性分为：特异性免疫治疗(specific immunotherapy)非特异性免疫治疗(non-specific ),根据治疗所用制剂分为：主动免疫治疗(active )被动免疫治疗(passive ),AbAgCKCellsdrug,（一）免疫增强疗法和免疫抑制疗法 1免疫增强疗法用途：治疗免疫功能低下的疾病种类：非特异性免疫增强剂、疫苗、抗体或淋巴细胞过继免疫疗法、细胞因子疗法。 2免疫抑制疗法用途：治疗免疫功能亢进的疾病种类：非特异性免疫抑制剂、淋巴细胞及其表面分子的抗体、诱导免疫耐受的疫苗。,（二）主动免疫治疗和被动免疫治疗1主动免疫治疗（active immunotheraphy）原理：给免疫应答健全的机体输入抗原性的疫苗或免疫佐剂，激活或增强免疫应答，使机体自身产生抵抗疾病的能力。制剂：疫苗；瘤苗、卡介苗、短小棒状杆菌等。2被动免疫治疗（passive immunotheraphy） 又称过继免疫治疗 adoptive immunotheraphy 原理：将对疾病有免疫力的供者的免疫应答产物转移给其他个体或自体细胞体外经处理后回输自身治疗疾病 制剂：抗体、小分子免疫肽（如转移因子、胸腺肽）、免疫效应细胞等。,（三）特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗 1特异性免疫治疗（1）主动特异性免疫治疗原理：利用Ag诱导机体对该特定Ag的刺激产生特异性免疫应答或免疫耐受，达到治疗的目的。特点：见效慢、维持时间长。（2）被动特异性免疫治疗原理：直接向机体输入特异性免疫应答产物，使机体立即获得针对某一抗原的应答或耐受。特点：见效快、维持时间短。,（三）特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗2非特异性免疫治疗 范围：广，包括非特异性免疫增强剂或免疫抑制剂的应用。 特点：作用无特异性；对机体免疫功能可广泛抑制；易致不良反应。,一、抗体为基础的免疫治疗,种类免疫血清 （第一代） 抗菌、抗病毒、抗毒素， 胎盘（丙种）球蛋白 ，ALG应用限制：动物来源（制备、纯化、免疫原性）， 病原变异、传播疾病（人源） 单克隆抗体 （第二代） 抗细胞表面分子单抗、抗CKs单抗、抗体导向药物治疗应用限制： 鼠源性（纯化）免疫原性差（肿瘤）,基因工程抗体（第三代） 将Ig各片段编码基因，人为拼接成Ig编码基因（VDJC、VJC）（重组DNA技术）并让其在原核或真核细胞大量表达 嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体单链抗体、双价抗体,(一）免疫血清：来自免疫动物或人体的血清 成分是多克隆抗体。1、抗毒素antitoxin2、丙种球蛋白（r-globulin）：胎盘球蛋白、人血浆丙种球蛋白3、人特异性免疫球蛋白4、抗菌免疫血清5、抗病毒免疫血清6、抗T细胞丙种球蛋白,（二）抗体,1、多克隆抗体（免疫血清）（1）抗毒素血清（antitoxic serum）性质：马血清用途：治疗和紧急预防外毒素所致疾病。常用制剂：白喉抗毒素、破伤风抗毒素等。（2）胎盘（丙种）球蛋白（placental globulin）用途：预防麻疹、传染性肝炎等，治疗丙种球蛋白缺乏症。常用制剂：胎盘球蛋白、人血清丙种球蛋白。特点：由于地区和人群免疫情况不同，制剂中所含抗体种类及数量不尽相同。（3）人特异性免疫球蛋白 来源：恢复期病人、含高效价特异性抗体的供血者 接受类毒素和疫苗免疫者的血浆,（二）抗体,（4）抗菌免疫血清（antibacterial immune serum）种类：抗鼠疫、抗炭疽、抗痢疾、抗百日咳等抗菌血清。特点：防治效果不显著，现已被磺胺类、抗生素所代替。（5）抗病毒免疫血清（antiviral immune serum）种类：抗麻疹免疫血清、抗狂犬病免疫血清、抗乙型脑炎免疫血清等。特点：预防作用显著，治疗效果不明显，因不能进入细胞内杀死病毒。（6）抗淋巴细胞丙种球蛋白（anti-lymphocyte globulin，ALG）制备：用T淋巴细胞免疫动物的免疫血清，经提纯制成作用：在补体协同下溶解T淋巴细胞，使外周血中T淋巴细胞减少。用途：预防移植排斥、治疗某些自身免疫病。,（二）单克隆抗体(monoclonal antibody) 特异性强，靶向性好，应用广泛,单抗类药物的类型：,1、抗细胞表面分子的单抗：,2、抗细胞因子的单抗：,3、抗体导向药物：,抗-CD3单抗，用于GVHD和HVGD的治疗,抗IL-1、抗TNFa单抗治疗类风湿关节炎、Crohn病,放射（131I，125I）免疫耦联物、化学（甲氨蝶呤）免疫耦联物、免疫毒素（蓖麻毒素、白喉毒素）耦联物,（二）抗体,2、单克隆抗体（1）抗细胞表面分子的单抗 用途：人CD3单抗移植排斥反应； 人CD4单抗预防移植排斥反应； 治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症等。 （2）抗细胞因子单抗 用途：抗IL-1、TNF单抗中和作用，减轻炎症反应。治疗类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病。,（二）抗体,2、单克隆抗体（3）抗体导向药物治疗由导向部分（mAb）和药物（化疗药物、毒素、同位素）两部分组成。 放射免疫疗法 同位素+mAb 抗体导向药物疗法 化疗药物+mAb 免疫毒素疗法 毒素+mAb,tumor,单抗治疗图,Immunotoxin: Antibody-Toxin Conjugate,Tumor cell,enzyme,抗体与酶分子偶联,prodrug,drug,enzyme,诱发人抗小鼠反应(，human anti-murine antibody)可降低抗体效果，甚至造成人体损伤半衰期较短,可较快被清除而影响疗效在人体中常不能有效激活补体和受体相关的效应系统,鼠源性单抗用于人体治疗存在的主要问题有,怎样制作人源化单抗？采取什么方法？,通过DNA重组和蛋白质工程技术，在基因水平上进行切割、拼接或修饰，重新组装成新的抗体分子。 特异性强、人源化、均一性强、可批量生产。,（三）基因工程抗体（genetic engineering antibody）,（1）嵌合抗体(鼠-人嵌合抗体) （chimeric antibody） 构成： 鼠源性抗体的V区人抗体的C区（2）人源化抗体（CDR移植抗体） （CDR grafted antibody） 构成：小鼠抗体CDR序列取代人源抗体CDR序列。（3）完全人源抗体 构成：将人Ig基因转染小鼠，刺激产生人抗体， 经杂交瘤技术大量产生制备。（4）小分子抗体 Ig被酶水解产生含有H链和L链V区的片段有结合抗原的能力。这些片段大小仅为抗体的1/3 1/12，故称为小分子抗体。小分子抗体也可以相互结合或与适当的配体结合。（5）双特异性抗体双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）又称双功能抗体（bifunction antibody，BfAb）， 构成：一个Ig的两个抗原结合部位可分别与两种不同的抗原表位结合。,基因工程抗体的类型：,1、人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）： 鼠源性抗体V区+人抗体C区， 也可将IgG2b转换成IgG1或IgG3，提高Ab的细胞毒性,在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起，所产生的抗体含有70-80%的人Ig分子的序列,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,免疫球蛋白基因载体的构建,H链嵌合载体,L 链嵌合载体,共转染细胞,启动子,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,鼠VH,鼠VL,人CL,人CH,抗体分泌细胞,人-鼠嵌合基因工程抗体,2、人源化抗体（humanized antibody）： 将鼠源性抗体的CDR区序列连接至人抗体框架， 也称为（CDR-grafted antibody）， 更进一步减少鼠抗体的成分,嵌合抗体、CDR移植抗体的比较,FDA已批准上市的部分嵌合抗体： 抗-CD20单抗（rituxinmab，利妥昔单抗），是针对CD20抗原的人鼠嵌合型单抗，通过介导ADCC、CDC杀伤肿瘤细胞。治疗B细胞淋巴瘤 抗Her-2单抗（trastuzumab，曲妥珠单抗），人源化单抗，治疗Her-2（EGFR）表达高的乳腺癌,Herceptin (抗体名称) 人源化抗体乳腺癌 cellHER-2,赛尼哌Zenapax。是靶向CD25抗原的人源化单抗，是第一个无严重不良反应的免疫抑制剂，适应症为预防无高度免疫的同种异体肾移植患者的器官排斥反应，与环孢素和皮质固醇的免疫抑制剂合用。,FDA已批准上市的部分嵌合抗体：,抗TNFa单抗（infliximab，英夫利昔单抗），是一种特异性阻断TNF-的人鼠嵌合型单抗，属TNF拮抗剂，治疗类风湿关节炎、Crohn病,目前有数百种抗肿瘤特异性MAb 进入临床试验。尤其在抗血癌领域MAb取得了很大成功。由于完整的Ab分子 不易渗透进实体瘤、透过血脑屏障，也不能口服，限制了其应用。,如何解决这个问题？,3.小分子抗体,酶解法：量？纯度？,（4）小分子抗体 Ig被酶水解产生含有H链和L链V区的片段有结合抗原的能力。这些片段大小仅为抗体的1/3 1/12，故称为小分子抗体。小分子抗体也可以相互结合或与适当的配体结合。 根据结构，可将小分子抗体分为4类。1Fab段 构成： VH、CH1L链2单域抗体和最小识别单位 构成：单域抗体（single domain antibody） VH或VL 最小识别单位（minimal recognition unit，MRU） 单个CDR3Fv片段： 构成：VHVL4单链抗体（single chain antibody，SCA）或单链Fv（ScFv） 构成：V L-不同的连接物-V H多肽链 特点：分子量小，穿透力强和体内清除快。,基因工程技术是当今较为成熟的技术！,免疫球蛋白基因载体的构建,H链表达载体,L链表达载体,共转染细胞,Pr VH CH1 Pr VL CL,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,Fab 抗体分子的制备,分别构建载体,L链表达载体,H链表达载体,Pr VH Pr VL,抗体分泌细胞,Fv小分子抗体的制备,3、小分子抗体：Fab段、Fv片段,1/3抗体,1/6抗体,Fv结构示意图,antigen binding fragment,Fab,variable domain fragment, Fv,3、小分子抗体：单域抗体(single-domain antibody, sdAb)、单链抗体,单域抗体 单链抗体(scFv),VH或VL单一结构域组成1/12抗体,由接头将VH-VL连接成一条链。1/6抗体,sdAb最初是从软骨鱼和骆驼科动物中克隆到有无轻链、单一重链可变区保留完整的抗原结合活性。具有分子小、稳定性高、体内组织渗透性好、可溶性好、易表达、抗原识别表位独特的特性。,最小识别单位、双特异性抗体,4、抗体库技术,抗体库技术产生的三项技术基础, RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术（phage display), 人源抗体的制备 抗体性能的改良 不经免疫制备抗体,抗体库技术的应用,抗体药物的临床应用,单克隆抗体,基因工程抗体,破伤风抗血清、蛇毒抗血清等,抗肿瘤 (鼠 , 人-鼠 ),抗肿瘤 , 自身免疫病,抗血清,二、抗原为基础的免疫治疗,治疗性疫苗（therapeutic vaccine）1、增强免疫应答2、诱导免疫耐受,（一）以抗原表位的形式进行的免疫治疗,HSP能与多种肽结合，形成HSP-肽复合物，能激活多个CTL克隆，因此HSP被称为“伴侣抗原肽（chaperone antigenic peptide）,抗原表位8-12个aa，易降解。与载体结合制成疫苗。,前体条件：需已知抗原肽序列。,（二）以抗原分子或片段的形式进行的免疫治疗,重组抗原疫苗：重组HBV表面抗原疫苗、Pre-S2疫苗；重组HPV疫苗等DNA疫苗：诱导对MBP（髓磷脂碱性蛋白）的免疫耐受，治疗小鼠EAE（人类MS）重组病毒疫苗：编码有效免疫原的基因插入减毒病毒（痘苗病毒、腺病毒），接种后体内持续产生抗原。转基因植物疫苗：将编码有效免疫原的基因插入可食用植物细胞中。,三、细胞因子及其拮抗剂为基础的免疫治疗,1、细胞因子疗法2、细胞因子阻断疗法3、细胞因子基因疗法,采用细胞因子及其拮抗剂进行的免疫治疗 细胞因子补充和添加疗法：常应用重组细胞因子作为生物应答调变剂治疗肿瘤、感染、造血障碍等疾病。 细胞因子阻断和拮抗疗法：主要用于治疗自身免疫性疾病、移植排斥、感染性体克等。 细胞因子基因疗法：将细胞因子或其受体基因导入体内，使其在体内持续表达并发挥治疗效应。目前多项基因疗法用于治疗恶性肿瘤、感染、自身免疫性疾病。,（一）细胞因子疗法 应用重组细胞因子作为药物,IFN、抗肿瘤细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN、TNF、GM-CSF促进造血细胞因子GM-CSF、G-CSF、EPO,（二）细胞因子阻断疗法 阻断细胞因子与其受体结合或信号转导,重组可溶性I型TNF受体（soluble TNF receptor I，sTNFRI）：治疗类风湿关节炎、感染性休克soluble IL-1 receptor，sIL-1R：抑制移植排斥反应、实验性自身免疫病sTGFRII：阻断TGF介导的免疫抑制和致纤维化作用TNF单抗IL-1RA（IL-1 receptor antagonist，IL-1受体拮抗剂）,（三）细胞因子基因疗法 体内持续表达CK或CKR,解决CK半衰期短、副作用大的问题细胞因子基因转染免疫效应细胞、肿瘤细胞、造血干细胞,四、细胞为基础的免疫治疗,1、造血干细胞移植2、免疫效应细胞疗法3、DC疗法,（一）造血干细胞移植 促进免疫重建，恢复造血功能,骨髓移植外周血干细胞移植脐血干细胞移植,（二）免疫效应细胞疗法 抗肿瘤、抗病毒感染,NK（natural killer cell）LAK（lymphokine activated killer cell）：IL-2活化的PBMC（NK）CIK（cytokine induced killer cell）：anti-CD3 McAb、IL-2、IFN-、TNF-联合活化的PBMC（NK T）TIL（tumor infiltrating