毕业答辩--曾林PPT课件.ppt

溶藻弧菌 Vibrioalginolyticus 噬菌体和菌影对凡纳滨对虾的免疫保护机理的初步研究 研究方向 水产经济动物病害与控制指导老师 邱德全教授级高工报告人 曾林 1 主要内容 4 1 2 3 研究的目的与意义 研究现状 实验内容与结果 致谢 2 研究的目的与意义 研究对象 1 凡纳滨对虾2 溶藻弧菌溶藻弧菌属于弧菌科 Vibrionaceae 弧菌属 Vibrio 为革兰氏阴性菌 是一种嗜盐嗜温的条件致病菌 危害 是鱼 虾 贝等水产经济动物的主要病原菌之一 感染该还会引发蜂窝组织炎或者中耳炎 食用被其污染的食物会引起食物中毒 防治意义重大 3 研究的目的与意义 本论文通过对噬菌体生理特性的测定 完善利用噬菌体制备溶藻弧菌菌影的方法 通过比较溶藻弧菌菌影 全菌疫苗以及脂多糖对凡纳滨对虾的免疫指标的影响 以探讨菌影对凡纳滨对虾的免疫保护机理 4 关于弧菌病防治的研究进展 经过学者多年的研究工作得到以下成果 抗生素和消毒剂脂多糖噬菌体疫苗防治 5 实验内容 溶藻弧菌及其噬菌体的分离溶藻弧菌噬菌体生物学特性的研究 改进利用噬菌体制作菌影的方法制备灭活疫苗和脂多糖 菌影疫苗 灭活全菌疫苗及脂多糖对凡纳滨对虾免疫保护效果及机理初探 1 2 3 6 溶藻弧菌的分离纯化 从湛江市水产品批发市场下水道采集水样 在TCBS平板上分离纯化 7 溶藻弧菌的鉴定 运动性实验用接种针沾取鉴定菌单菌落 穿刺培养 24 48h后观察 穿刺线周围云雾状 说明溶藻弧菌有运动性 革兰氏染色经革兰氏染色镜检呈现红色 革兰氏染色菌为阴性杆菌 两端钝圆 生化鉴定利用新型微生物微量生化鉴定盒做生化鉴定分子鉴定toxR基因序列的PCR扩增与测序 扩增出溶藻弧菌特有的大小为161bp的扩增片段 符合溶藻弧菌的特征 8 分子鉴定 图1溶藻弧菌的PCR检测 1 Maker 2 副溶血弧菌 3 哈维氏弧菌 4 鳗弧菌 5 霍乱弧菌 6 溶藻弧菌 已鉴定的标准株 7 分离的菌株 9 溶藻弧菌噬菌体的分离纯化 水样采集 样本 蛋白胨水 生长对数期宿主菌悬液 混匀35 过夜培养培养液离心 0 22 m滤膜推滤 取少许滤液滴在铺有细菌的平板上 35 过夜培养观察平板上是否有透明斑块 如有 用双平板法得到单个噬菌斑挑单个噬菌斑 浸泡于无菌海水 铺双平板 重复该步骤3次 可得到纯化的噬菌体 10 溶藻弧菌噬菌体生理特性的研究 紫外线 pH 噬菌体与宿主菌混合时间 热稳定性 理化因子对噬菌体出斑率的影响 以及噬菌体的最佳感染复数 MOI 的测定 为探索噬菌体裂解的最佳条件 11 利用噬菌体制作菌影的过程 12 培养基反应体系灭菌效果 图2培养基反应体系灭菌效果图 反应开始后2h内 细菌数量有所下降 从4h开始细菌数量开始持续增加 甚至超过初始细菌数量 13 改进后的无菌海水反应体系灭菌效果 图3无菌海水反应体系灭菌效果图 除MOI为100 1000以外的各组反应开始后细菌数量均低于初始细菌数量 其中MOI为10 反应6h时细菌浓度最低 14 菌影的计数方法 原理 一定数量的细菌释放出的DNA的量一定 图4双链DNA浓度 细菌浓度标准曲线 15 大蒜提取液对溶藻弧菌的灭活效果 以1 1的比例混合 3 5h就能灭活残余活菌 表5大蒜提取液的除菌效果 16 改进后菌影制作方法 将培养6h的溶藻弧菌用海水多次洗涤除去培养基 以MOI 10的比例与噬菌体于无菌海水中混合 反应6h后 离心取上清液测定其中的双链DNA含量 通过方程y 8E 06x 4E 06计算菌影含量 将大蒜液与反应后的菌影以1 1的比例混合反应4h后 用无菌海水多次洗涤以除去残余大蒜液 4 保存备用 17 灭活疫苗和脂多糖的制备 采用福尔马林灭活法制备灭活疫苗 4 保存备用采用酚水法 提取到多糖含量为190 7 g mg 蛋白含量为22 1 g mg的脂多糖冻干产物 制备的菌影 灭活疫苗和脂多糖均要进行安全性实验 18 注射免疫实验方案 将菌影分为Y1 Y2 Y3三组 浓度分别调整为1 106 1 107 1 108cells mL 将全菌疫苗分为M1 M2 M3三组 浓度分别调整为1 106 1 107 1 108cells mL 将LPS分为L1 L2 L3三组 浓度分别调整为0 5 1 2mg mL 将3种免疫增强剂分别以0 1mL的剂量注射免疫凡纳滨对虾 对照组不注射 阴性对照组注射0 1mLPBS 19 投喂免疫实验方案 菌影按1 108 1 109 5 109cell g饲料的剂量与粤海南美白对虾2 饲料拌匀 命名为YT1 YT2 YT3 20 检测指标 超氧化物歧化酶 SOD 酚氧化酶 PO 血淋巴细胞比例血淋巴细胞吞噬率免疫保护率 21 溶藻弧菌全菌疫苗 脂多糖及菌影对凡纳滨对虾免疫功能的影响 对超氧化物歧化酶的影响图5四种免疫方法对血清SOD活力的影响 A 注射灭活全菌疫苗B 注射LPSC 注射菌影D 投喂菌影 注射疫苗后 SOD活力显著高于对照组 P 0 05 注射LPS后 仅部分处理组显著高于对照组 P 0 05 在投喂菌影后SOD活力显著高于对照组 P 0 05 血清SOD活力随受免时间的延长而逐渐降低 P 0 05 22 溶藻弧菌全菌疫苗 脂多糖及菌影对凡纳滨对虾免疫功能的影响 酚氧化酶 PO 活力的变化图6四种免疫方法对血清PO活力的影响 A 注射灭活全菌疫苗B 注射LPSC 注射菌影D 投喂菌影 血清中PO活力随受免时间的延长而增强 P 0 05 受免24h时血清PO活力显著高于受免12h和48h P 0 05 血清PO活力随受免时间的延长而逐渐降低 P 0 05 随着受免时间的延长 血清中的PO活力逐渐增强 P 0 05 23 注射灭活疫苗和投喂菌影对凡纳滨对虾血淋巴细胞比例的影响 增加 24 注射LPS对凡纳滨对虾血淋巴细胞比例的影响 增加 25 注射菌影对凡纳滨对虾血淋巴细胞比例的影响 下降 26 对血淋巴细胞吞噬率的影响 增加 增加 增加 27 四种免疫方法的免疫保护率 57 14 57 14 53 56 28 57 图7四种免疫方法的免疫保护率 A 注射灭活全菌疫苗B 注射LPSC 注射菌影D 投喂菌影 28 四种免疫方法对PO活性的影响机理 LPS免疫凡纳滨对虾时 其血淋巴中SG细胞比例逐渐升高 PO的活力也增强 这说明用LPS免疫对虾 可通过SG细胞的增加而提高PO的活力注射疫苗或投喂菌影后 血淋巴中G细胞的比例上升的同时 PO活力和吞噬活性增强 免疫保护力也随着增强 注射菌影后 G细胞的比例下降的同时PO活力也下降 表明这三种免疫方法是通过G细胞的增生而提高PO的活力 29 灭活疫苗 脂多糖与菌影最佳免疫效果的比较 菌影疫苗和灭活疫苗免疫效果差异不显著 P 0 05 LPS激发SOD活力的效果不如灭活疫苗和菌影 图8各免疫指标最佳效果对比 A 免疫保护率B 血细胞吞噬率C PO活性D SOD活性 从PO活性 血淋巴细胞吞噬率 以及免疫保护率来看 用注射的方法使用菌影效果显著优于投喂的方法 30 结论 1 将菌影以1 107cells mL的浓度注射免疫凡纳滨对虾 在受免后的12h时免疫保护率最高 达到53 56 与疫苗和脂多糖的免疫效果差异不显著 P 0 05 菌影以1 109cell g饲料的剂量投喂免疫对虾48h后 免疫保护率最高 达到28 57 2 菌影和疫苗通过促使G细胞的增生而提高PO活力 LPS通过提高SG细胞的数量而提高PO活力 高浓度 2mg mL 的LPS可以提高PO活力 但同时也会有较强的毒害作用 3 LPS提高凡纳滨对虾SOD活力的效果不如菌影和疫苗 4 菌影对凡纳滨对虾的免疫保护效果可以和灭活疫苗相媲美 31 致谢 本论文是在我的导师邱德全老师的悉心指导下完成的 在此 谨向邱老师致以崇高的敬意和衷心的感谢 同时感谢师母在实验和生活中给予的关心和帮助 此外 在实验的过程中还得到了邬长祥 孙武卫 邓一清 曾雯娉等多位同学以及师姐于鸽 师弟谢警鸿的帮助 由于人数众多 在此一并表示感谢 你们给予我的帮助我将铭记于心 感谢研究生三年以来所有传授过我知识 帮助过我的老师 还有给予我精神上支持的同学和朋友 感谢你们的关心 支持和帮助 尤其要感谢我的父母 他们为了我的学习付出了他们的青春 汗水乃