Northern-Blot印迹杂交

NorthernBlot 湖南师范大学生命科学学院刘如石博士 副教授 一 实验目的 1 掌握Northernblot的实验原理与操作技术 2 了解Northernblot的实验在分子生物学与转基因领域的应用 二 实验原理 在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳 然后将分离的RNA转移到尼龙膜 然后用放射性标记的探针进行杂交检测 最后进行放射性自显影 用途 检测样品中是否含有基因的转录产物 mRNA 及其含量 三 实验材料 1 仪器恒温水浴箱 电泳仪 凝胶成像系统 真空转移仪 真空泵 UV交联仪 杂交炉 恒温摇床 脱色摇床 漩涡振荡器 分光光度计 微量移液器 电炉 或微波炉 离心管 烧杯 量筒 三角瓶等 2 材料总RNA样品或mRNA样品 探针模板DNA 25ng 尼龙膜 3 试剂NorthernMaxKit Cat 1940 Ambion Inc 琼脂糖 DEPC X光底片 底片暗盒 RandomPrimer dNTPMixture 111TBq mmol a 32P dCTP Exo freeKlenowFragment和10XBuffer SephadexG 50 SDS 双氧水 灭菌水等 四 实验步骤 1 用具的准备 180度烤三角锥瓶 量筒 镊子 刀片等4h 清洗梳子和电泳槽 并用双氧水浸泡过夜 用DEPC diethypyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 水冲洗 干燥备用 处理DEPC水 2L 备用2 RNAZaP去除用具表面的RNase污染 用RNAZap擦洗梳子 电泳槽 刀片等 然后用DEPC水冲洗二次 去除RNAZap 3 制胶 称取0 36mg琼脂糖加入三角锥瓶中 加入32 4mlDEPC水后 微波炉加热至琼脂糖完全熔解 60 空气浴平衡溶液 需加DEPC水补充蒸发的水分 加入3 6ml10 DenaturingGelbuffer 轻轻振荡混匀 注意尽量避免产生气泡 将熔胶倒入制胶板中 插上梳子 注 胶的厚度不能超过0 5cm 胶在室温下完全凝固后 将胶转移到电泳槽中 加入1 MOPSGelRunningbuffer盖过胶面约1cm 检查点样孔 4 RNA样品的制备 在RNA样品中加入3倍体积的formaldehydeloaddye和适当的EB 混匀后 65 15min 短暂低速离心后 立即放置于冰上5min 5 电泳 将RNA样品小心加到点样孔中 5V cm下进行电泳 在电泳过程中 每隔30min短暂停止电泳 取出胶 混匀两极的电泳液后继续电泳 当胶中的溴纷蓝接近胶的边缘时终止电泳 紫外灯下 检验电泳情况 并用尺子测量18S 28S 溴纷蓝到点样孔的距离 注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间 6 转膜 用3 双氧水浸泡真空转移仪 用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏 用DEPC水冲洗二次 连接真空泵和真空转移仪 剪取一块适当大小的膜 在Transferbuffer浸湿5min后 放置在多孔渗水屏的适当位置 盖上塑胶屏 盖上外框 扣上锁 将胶的多余部分切除 切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔 并至少盖过边缘约2mm 以防止漏气 将胶小心放置在膜上 膜与胶间不能有气泡 7 打开真空泵 使压强维持在50 58mbar 立即将transferbuffer加到胶面和四周 每隔10min在胶上加1mltransferbuffer 转移2h 8 转膜后将膜于1 MOPSGelRunningbuffer中轻轻泡洗10sec 去残余胶和盐 9 用吸水纸吸取膜上多余的液体后 将膜置于UV交联仪中自动交联 10 将胶和紫外交联后的膜 在紫外灯下检测转移效率 避免太长的紫外曝光时间 11 将膜在 20 保存 12 探针的制备 在1 5ml离心管中配制以下反应液 模板DNA 25ng 1 l RandomPrimer2 l 灭菌水11 l 总体积 14 l 95 加热3min后 迅速放置于冰冷却5min 在离心管中按下列顺序加入以下溶液 10 Buffer2 5 ldNTPMixture2 5 l111TBq mmol a 32P dCTP5 lExo freeKlenowFragment1 l混匀后 25ul 37 下反应30min 短暂离心 收集溶液到管底 65 加热5min使酶失活 13 探针的纯化及比活性测定 准备凝胶 将1g凝胶加入30mlDEPC水中 浸泡过夜 用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次 以除去可溶解的葡聚糖 换用新配的TE pH7 6 取1ml的注射器 去除内芯推扞 将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住 在注射器中装填12SephadexG 50 将注射器放入一支15ml离心管中 注射器把手架在离心管口上 1600g离心4min 凝胶压紧后 补加SephadexG 50凝胶悬液 重复此步直至凝胶柱高度达注射器0 9ml刻度处 100 lSTE缓冲液洗柱 1600g离心4min 重复3次 倒掉离心管中的溶液后 将一去盖的1 5ml离心管置于15ml管中 再将装填了SephadexG 50凝胶的注射器插入离心管中 注射器口对准1 5ml离心管 将标记的DNA样品加入25 lSTE 取出0 5 l点样于DE8 paper上 其余上样于层析柱上 1600g离心4min DNA将流出被收集在去盖的离心管中 而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中 取0 5 l己纯化的探针点样于DE8 paper 测比活性 试剂比活要求 106cpm ml 14 预杂交 将预杂交液在杂交炉中68 预热 并漩涡使未溶解的物质溶解 加入适量的ULRAhyb到杂交管中 100cm2加入10mlULRAhyb杂交液 42 预杂交4h 15 探针变性 用10mMEDTA将探针稀释10倍 90 热处理稀释后探针10min 立即放置于冰上5min 短暂离心 将溶液收集到管底 16 杂交 加入0 5mlULTRAhyb到变性的探针中 混匀后 将探针加到预杂交液中 42 杂交过夜 14 24h 杂交完后 将杂交液收集起来于 20 保存 17 洗膜 加入HighStringencyWashSolution2 100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液 42 摇动洗膜20min两次 18 曝光 将膜从洗膜液中取出 用保鲜膜包住 以防止膜干燥 检查膜上放射性强度 估