《酶分子的化学修饰》PPT课件.ppt

Chapter8ModificationofEnzymeMolecule 酶分子的化学修饰 Contentsofchapter8 1 酶分子化学修饰的基本原理 2 酶分子化学修饰的方法学 3 肽链有限水解修饰 4 酶分子的侧链基团修饰 Go Go Go Go 5 大分子的结合修饰 Go 6 亲和标记 Go 8 1酶分子化学修饰的基本原理 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰 即 在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团 物质 特别是具有生物相容性的物质 进行共价连接 从而改变酶的结构和性质 1 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团 可与酶形成多点交联 使酶的天然构象产生 刚性 结构 2 如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后 产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂 遮盖 了酶的活性部位 三 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶 1 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子 遮盖 酶分子上敏感键免遭破坏 2 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后 减少了受蛋白水解酶破坏的可能性 四 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇 与修饰剂形成了共价键 破坏了抗原决定簇 抗原性降低乃至消除 遮盖 了抗原决定簇 阻碍抗原 抗体结合2 大分子修饰剂本身是多聚电荷体 能在酶分子表面形成 缓冲外壳 抵御外界环境的极性变化 维持酶活性部位微环境相对稳定 酶分子修饰的意义 提高酶的活力activity增强酶的稳定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和了解酶分子中主链 侧链 组成单位 金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响structure 8 2酶分子化学修饰的方法学 对酶分子进行修饰必须在修饰原理 修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解 1 酶的稳定性热稳定性 酸碱稳定性 作用温度 pH 抑制剂等 2 酶活性中心的状况活性中心基团 辅因子等 其他如分子大小 性状 亚基数等 酶分子修饰的条件 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行 并尽量不破坏酶活性功能的必需基团 使修饰率高 同时酶的活力回收高 1 pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态 由于它们的解离状态不同 反应性能也不同 2 修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应 3 反应体系中酶与修饰剂的比例 8 3肽链有限水解 利用酶分子主链的切断和连接 使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变 从而改变酶的特性和功能的方法 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切 酶原激活法 a 胃蛋白酶原的激活 酶蛋白的肽链被水解后 可能出现以下三种情况中的一种 1引起酶活性中心的破坏 酶失去催化功能 2仍维持活性中心的完整构象 保持酶活力 3有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位 酶活力提高 后两种情况 肽链的水解在限定的肽键上进行 称肽链有限水解 b 胰蛋白酶原 trypsinogen 的激活 c 胰凝乳蛋白酶原 chymotrypsinogen 的激活 通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应 从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法 可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构 特性和功能的影响 在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用 酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团 主要包括氨基 羧基 巯基 胍基 酚基等 这些基团可以形成各种副键 对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用 侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变 从而改变酶的特性和功能 20种不同氨基酸侧链基团中只有极性氨基酸侧链易被修饰 它们一般具有亲核性 8 3酶分子的侧链基团修饰 催化活性 非催化活性基团的修饰 对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质 改变酶对特殊底物的束缚能力 经常被修饰的残基是 亲核的Ser Cys Met Thr Lys His亲电的Tyr Trp对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代 1 非极性R基氨基酸 共8种 丙氨酸 Alanine Ala A 亮氨酸 Leucine Leu L 缬氨酸 Valine Val V 异亮氨酸 Isoleucine Ile I 苯丙氨酸 Phenylalanine Phe F 色氨酸 Tryptophan Trp W 甲硫氨酸 Methionine Met M 脯氨酸 Proline Pro P 根据氨基酸侧链R基的极性 20种氨基酸可分成4类 2 无电荷的极性R基氨基酸 共7种 丝氨酸 Serine Ser S 苏氨酸 Threonine Thr T 酪氨酸 Tyrosine Tyr Y 半胱氨酸 Cysteine Cys C 天冬酰胺 Asparagine Asn N 甘氨酸 Glycine Gly G 谷氨酰胺 Glutamine Gln Q 3 带正电荷的极性R基氨基酸 共3种 赖氨酸 Lysine Lys K 精氨酸 Arginine Arg R 组氨酸 Histidine His H 4 带负电荷的极性R基氨基酸 共2种 天冬氨酸 Asparticacid Asp D 谷氨酸 Glutamicacid Glu E 烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应磷酸化反应 几种重要的修饰反应 酰化及其相关反应 试剂特点 含有结构 作用于侧链基团上的亲核基团 使之酰基化 乙酰咪唑 二异丙基磷酰氟 酸酐磺酰氯等可作用基团 氨基 巯基 醇羟基 Ser Thr 酚羟基 Tyr 烷基化反应 试剂特点 烷基上带活泼卤素 导致酶分子的亲核基团 如 NH2 SH等 发生烷基化 可作用基团 氨基 Lys Arg 巯基 Cys 羧基 Asp Glu 甲硫基 Met 咪唑基 His 修饰剂 2 4 二硝基氟苯 碘乙酸 碘乙酰胺等 氧化和还原反应 试剂特点 具有氧化性或还原性 氧化剂 H2O2 N 溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团 巯基 甲硫基 吲哚基 Trp 咪唑基 酚基等 还原剂 2 巯基乙醇 DTT等 可被还原的侧链基团 二硫键 芳香环取代反应 I2 HI 肽酰高丝氨酸内酯 C端肽段 N端肽段 甲基硫氰酸 磷酸化反应 蛋白质磷酸化是由蛋白激酶催化将ATP中的磷酸基团转移到氨基酸残基的功能集团上 常见的磷酸化修饰的基团 丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸的羟基 来源 Lys Arg His Gln修饰反应 酰基化与烷基化酰基化修饰剂 三硝基苯磺酸 TNBS 丹磺酰氯 DNS 烷基化修饰剂 2 4 二硝基氟苯 DNFB 碘乙酸 碘乙酰胺 亚硝酸等 常见基团的化学修饰反应 氨基 特定的氨基酸残基侧链基团的化学修饰 巯基的化学修饰氨基的化学修饰羟基的化学修饰咪唑的化学修饰胍基的化学修饰二硫键的化学修饰 巯基的化学修饰 5 5 二硫 2 硝基苯甲酸 DTNB 氨基的化学修饰 N 乙基马来酰亚胺 NEM 氨基的化学修饰 氨基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫键的化学修饰 二硫键的化学修饰 二硫键的化学修饰 各种氨基酸侧链的修饰剂 但解释修饰效果须十分小心 因为 任何一种修饰剂不是绝对专一的 有些修饰剂引起蛋白质构象变化 失活 不一定是活性中心基团被共价修饰 不同部分的相同基团 修饰效果不同 分子内部的必需基团 不易被修饰 8 5酶的大分子修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物 如聚乙二醇 右旋糖苷等 它们既能通过氢键固定在酶分子表面 也能通过氢键有效地与外部水相连 从而保护酶的活力 一些添加物 如多元醇 多糖 多聚氨基酸 多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力 另一类添加物就是蛋白质 蛋白质分子之间相互作用时 其表面区域内排除了水分子 因而增加了相互作用力 其稳定性也就增加了 非共价修饰 用可溶性大分子 如聚乙二醇 右旋糖苷 肝素等 通过共价键连接于酶分子的表面 形成一层覆盖层 例如 用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 不仅可以降低或消除酶的抗原性 而且提高了抗蛋白酶的能力 延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效 每分子核糖核酸酶与6 5分子的右旋糖酐结合 可以使酶活力提高到原有酶活力的2 25倍 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合 酶活力达到原有酶活力的5 1倍 共价修饰 大分子修饰 共价 的过程 修饰剂的选择 大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子 例如 聚乙二醇 PEG 右旋糖酐 蔗糖聚合物 Ficoll 葡聚糖 环状糊精 肝素 羧甲基纤维素 聚氨基酸等 要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子 修饰剂的活化 作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起 在使用之前一般需要经过活化 然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应 修饰 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液 以一定的比例混合 在一定的温度 pH值等条件下反应一段时间 使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合 对酶分子进行修饰 分离 需要通过凝胶层析等方法进行分离 将具有不同修饰度的酶分子分开 从中获得具有较好修饰效果的修饰酶 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性 在体内无毒性 无残留 无免疫原性 并可消除酶的抗原性 使其末端活化后可以与酶产生交联 因而 它被广泛用于酶的修饰 8 6酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子 使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰 淀粉酶中的钙离子 Ca2 谷氨酸脱氢酶中的锌离子 Zn2 过氧化氢酶分子中的铁离子 Fe2 酰基氨基酸酶分子中的锌离子 Zn2 超氧化物歧化酶分子中的铜 锌离子 Cu2 Zn2 若从酶分子中除去其所含的金属离子 酶往往会丧失其催化活性 如果重新加入原有的金属离子 酶的催化活性可以恢复或者部分恢复 若用另一种金属离子进行置换 则可使酶呈现出不同的特性 有的可以使酶的活性降低甚至丧失 有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性 金属离子置换修饰的过程 a 酶的分离纯化 首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化 除去杂质 获得具有一定纯度的酶液 b 除去原有的金属离子 在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂 如乙二胺四乙酸 EDTA 等 使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物 通过透析 超滤 分子筛层析等方法 将EDTA 金属螯合物从酶液中除去 此时 酶往往成为无活性状态 c 加入置换离子 于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子 酶蛋白与新加入的金属离子结合 除去多余的置换离子 就可以得到经过金属离子置换后的酶 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶 用于金属离子置换修饰的金属离子 一般都是二价金属离子 8 7酶分子的物理修饰 通过物理修饰 可以了解不同物理条件下 特别是在极端条件下 高温 高压 高盐 极端pH值等 由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况 特点在于不改变酶的组成单位及其基团 酶分子中的共价键不发生改变 只是在物理因素的作用下 副键发生某些变化和重排 8 8酶修饰后的性质变化 热稳定性 一般来说 热稳定性有较大的提高 抗原性 比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显 各类失活因子的抵抗力 修饰酶对蛋白酶 抑制剂均有一定的抵抗能力 从而提高其稳定性 半衰期 一般在体内的半衰期得到有效延长 由于酶分子经修饰后 增强对热 蛋白酶 抑制剂等的稳定性 从而延长了在体内的半衰期 最适pH 大部分酶经化学修饰后 酶的最适pH发生了变化 这种变化在应用研究上有时具有重要意义 修饰酶最适pH更接近于生理环境 在临床应用上有较大意义 Km的变化 大多数酶经修饰后 Vm没有明显变化 但有些酶经修饰后 Km值变大 8 9酶分子修饰的应用 目前改造酶分子的方法主要有两种 即化学修饰法和生物酶工程法 化学修饰法用化学方法对酶分子迸行改造 即体外在酶的侧链基团上接上或去掉一些化学基团 从而改变酶的物理化学性质 最后达到改变酶的催化性质的目的 酶分子的化学修饰法技术较简单 但大多数酶经修饰后 理化及生物学性质会发生改变 因此应根据具体情况选定修饰方法 同时应注意采取一些保护性措施来尽量维持酶的稳定性及得率 生物酶工程法酶的化学修饰法并非改造酶的惟一手段 随着人们对酶的深入研究以及氨基酸一级结构的测定 基因重组技术的应用等 可以彻底地改造 合成并且模拟酶 这也就是生物酶工程的主要内容 生物酶工程主要包括基因工程技术生产酶和蛋白质工程技术改造酶两方面内容 一 在酶学研究方面的应用 酶的活性中心研究酶的空间结构研究酶的作用机制 1 亲和标记法 2 差别标记法 3