乳酸脱氢酶活力测定.ppt

目的要求 1 学习LDH活力测定原理 2 测定动物肌肉组织提取液LDH活力及比活力 原理 乳酸脱氢酶 lactatedehydrogenase 简称LDH 广泛存在于动物 植物及微生物细胞内 是糖代谢酵解途径的关键酶之一 可催化如下反应 LDH乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H pH7 4 7 8 LDH可溶于水或稀盐溶液 可制备组织匀浆 经浸泡 离心 得上清为组织提取液 LDH测定方法很多 紫外分光光度法最为简便快速 鉴于NADH和NAD 在340nm和260nm处有各自最大吸收峰值 因此以NAD 为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变 定量测定酶的含量 本实验反应液中含丙酮酸及NADH 在一定条件下加入一定量酶液 观察NADH在反应过程中340nm处光吸收减少值 减少越多 则LDH活力越高 其活力单位定义为 在25 pH7 5条件下A340nm min下降为1 0的酶量为1个单位 可定量测定每克湿重组织中LDH单位 定量测定蛋白质含量即可计算比活力 U mg 试剂与器材 材料 动物的肌肉 肝 心 肾等组织 匀浆缓冲液 10mmol LpH6 5磷酸氢二钾 磷酸二氢钾缓冲液 酶活力测定试剂 1 0 1mol LpH7 5磷酸缓冲液 PB 100ml 2 NADH溶液 3 5mg纯NADH以0 1mol LpH7 5PB1ml稀释 3 丙酮酸溶液 2 5mg丙酮酸钠 以以0 1mol LpH7 5PB29ml稀释 试剂 2 3 最好在临用前配制 操作方法 一 制备肌肉匀浆 二 LDH活力测定 三 蛋白质含量测定 四 数据处理 一 制备肌肉匀浆 取瘦猪肉 或兔肉 一块除去脂肪及筋膜等 称取20g 按W V 1 4比例加入4 预冷的10mmol LpH6 5磷酸氢二钾 磷酸二氢钾缓冲液 用组织捣碎机捣碎 每次10s 连续3次 将匀浆液倒至烧杯中 置4 冰箱提取过夜 过滤后的红色液体为组织提取液 量总体积 二 LDH活力测定 实验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25 水浴中预热 取2只光径为1cm的石英比色皿 在一只比色皿中加入0 1mol LpH7 5磷酸盐缓冲液3ml 置紫外分光光度计中 于340nm处调A值为0 另一只比色皿用于测定LDH活力 依次加入2 9ml丙酮酸溶液 0 1mlNADH溶液 加盖摇匀后测定A340nm 然后加入经稀释 20倍 的酶液10 l 立即计时 每隔0 5min测A340nm 连续测定3min 以A对时间作图 取最初线性部分 计算 A340nm min减少值 三 蛋白质含量测定 将组织提取液稀释适当倍数 约1 20 取0 1ml按Folin 酚法测定蛋白质含量 四 数据处理 每毫升组织提取液中LDH活力单位 LDH比活力总LDH活力 U 比活力 U mg 总蛋白含量 mg A340nm min 稀释倍数LDH活力单位 U ml提取液 酶液加入量 10 l 10 3提取液中LDH总活力单位 LDH活力 U ml 总体积 注意事项 1 实验材料应尽量新鲜 如取材后不立即用 应贮存在 20 低温冰箱中 2 酶液的稀释度及加入量应控制A340 nm下降在0 1 0 2之间 以减少实验误差 加入酶液后应立即计时 准确记录每隔0 5minA340下降值 3 NADH溶液应在临用前配制 如其纯度为75