SNP-检测方法.ppt

单核苷酸多态性 SNP 林壹明2011 5 9 主要内容 一 SNP概念 分类与特点二 SNP检测技术三 SNP研究现状四 SNP应用前景 SNP singlenucleotidepolymophism 即单核苷酸多态性 是指群体中变异频率大于1 的单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性 包括转换 颠换 缺失和插入 但是比较常见的是转换和颠换 大约占80 一般来说 一个SNP位点只有两种等位基因 因此又叫双等位基因 SNP在人基因组中的发生频率比较高 大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点 SNP概念 SNP分类 根据在基因中的位置 SNP可分为基因编码区SNP codingSNP cSNP 基因内含子区SNP和基因调控区SNP regulatorySNP rSNP 其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP synonymouscSNP 和非同义cSNP non synonymouscSNP SNP的主要特征 一 密度高 SNPs在人类基因组中的总数超过300万 二 遗传稳定性好 三 分布不均匀 非编码区的数目远远大于编码区的数目 四 具有代表性 五 分析易自动化 由于每个SNP位点通常仅含两个等位基因 双等位基因 biallele 在检测时能通过一个简单的 分析进行基因型分型 而无需分析片段的长度 因而易于自动化 SNP检测技术 理想的检测SNPs的方法 发现未知的SNPs 或检测已知的SNPs必须具备以下优点 1 适合自动化操作 简便 迅速 2 分析费用低 特殊试剂用量少 3 反应要严紧 即使不纯的样品也可得到可靠的结果 4 数据分析简单 易于自动化分析 5 反应的通量要大而灵活 一天可以完成几百 甚至到上百万个样品的检测与分析 现在常用的SNP检测技术 1 基于杂交的方法2 基于酶的方法3 电泳法4 直接测序法另外还包括化学法 如高锰酸钾法 物理法 例如基质辅助的激光吸附 离子化飞行时间质谱分析 等 1 基于杂交的方法 原理 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时 在完全匹配和有错配两种情况下 根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs位点检测出来 Tm差异越大 检测的特异性就越好 分为 1 利用 Tm 2 杂交 荧光探针 1 利用 Tm 固定温度等位基因特异核苷酸探针 Allele specificoligonucleotide ASO 修饰过的探针 引入一个错配的碱基 PNA LNAs等动态的加热过程动态等位基因特异杂交 dynamicallele specifichybridization DASH 核酸肽探针 Peptidenucleicacids PNA 其骨架是肽键特点 1 与靶分子高特异性地结合 3个方面的影响 2 链挤入 形成三链复合结构 表达调控以及反义治疗方面 3 对核酸酶和蛋白酶均不敏感 体外应用 与靶分子高特异性地结合 Tm值高受盐浓度影响小 低盐浓度的体系 Tm更大 一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8 20度 所以 PNA DNA的非特异结合能得到很好的排除 LNA lockednucleicacids 其结构是在RNA分子的2 羟基和核糖环的4 碳原子间连入一个亚甲基的 桥 特点 1 能以很高的亲和性和互补的DNA RNA或LNA结合 构象更利于杂交的稳定 2 匹配和不匹配之间的 Tm增加 DASH dynamicallele specifichybridization 2 杂交 荧光探针 分子信标 双分子间杂交 分子信标 Molecularbeacons 是在样品PCR过程中因和样品DNA杂交后而使自身荧光构象改变从而实现SNP的检测 分子信标是一种新型的发夹结构的寡核苷酸探针 2 基于酶的方法 1 DNA聚合酶2 连接酶3 限制性内切酶4 外切酶FEN5 RNaseH DNA聚合酶法 Taqman法单碱基延伸法焦磷酸测序法 此类方法是根据PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对SNP位点的检测 是基于以下两点 1 错配出现在引物中部时致使稳定性降低 在严格杂交条件下将不能退火 2 错配出现在引物3 端时 引物将不能延伸 因此针对不同等位基因设计平行引物 上游引物的3 端和多态性位点互补 这样只有和引物完全互补的序列才能得到扩增 不同的等位基因依赖于所使用的不同引物分别得以扩增 产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或实时的荧光测定来实现对其的分析 Taqman法 优点 闭管进行 减少污染 缺点 淬灭难以彻底 本底较高 单碱基延伸法 singlebaseextension 基本步骤 1 设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA 2 对PCR产物进行纯化 去除引物和dNTP 3 引物延伸 4 延伸产物检测 放射性同位素标记法 发光检测法 凝胶为基础的荧光检测法 质谱分析法 变性高压液相色谱法等 焦磷酸测序法 Pyrosequencing 原理 DNA聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应 而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放 焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种化学发光反应 通过发光计的实时监测来达到检测的目的 基本步骤 1 测序引物和DNA模板杂交 PCR扩增的 单链的 与酶和底物孵育 2 四种dNTP dATPS dTTP dCTP dGTP 之一被加入反应体系 如与模板配对 与引物的末端形成共价键 dNTP的焦磷酸基团 PPi 释放出来 3 一系列的酶学反应 发出可见光信号 每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比 4 ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解 淬灭光信号 并再生反应体系 5 然后加入下一种dNTP 3 电泳法 电泳法 就是利用电泳的方法对含有SNP的寡核苷酸链进行分离检测的技术 SSCP单链构象多态性 singlestrandconformationpolymorphism DGGE TGGE变性梯度凝胶电泳 denaturinggradientgelelectrophoresis SSCP单链构象多态性 singlestrandconformationpolymorphism 原理 非变性条件下 单链DNA single strandedDNA 简称ssDNA 链内碱基发生卷曲而形成一个较稳定的空间构象 DNA序列的改变会使卷曲DNA分子构象发生变化 所以 有序列差异的DNA分子通过非变性凝胶时 由于构象不同 所受到的阻力大小也就不同 结果是涌动速度的不同 从而达到分离的目的 1 内切酶降解DNA样品 然后做变性处理 2 在非变性PAGE电泳上进行电泳 但是 该方法的分辨率较差 4 直接测序法 直接测序法 该方法是将获得的DNA序列直接进行测序 然后与标准的序列进行比对 对序列中的SNP进行检测的方法 该方法检测能力一般 而且由于成本比较高 不适合大规模筛查SNP SNP研究现状 一 SNPs数据库 二 基于SNPs研究的单倍型图谱计划 HaplotypeMapProject 三 SNPs在复杂疾病研究中的现状 SNPs数据库 SNPs是伴随着HGP发展起来的 HGP的迅速发展为SNPs的应用提供了可行性 而鉴定人类DNA序列的差异 寻找基因组中更多的SNPs是HGP下一步的重要目标 目前 不同基因的详细SNP图谱逐渐被完成 常用的SNPs数据库 NCBIdbSNP是主要的SNPs数据库 http www ncbi nlm nih gov SNP 由美国国立生物技术信息中心 NCBI 和国家人类基因组研究所 NHGRI 共同组建 TSC数据库 http snp cshl org 由SNP国际协会建立 JSNP数据库 http snp ims utokyo ac jp index html 始建于2000年4月 是由人类基因组中心 HGC 医学科学研究院 IMS 东京大学 日本科技公司 JST 合办 基于SNPs研究的单倍型图谱计划 寻找标记SNPs的国际遗传变异图谱计划 即国际单倍型图谱计划 HaplotypeMapProject 已于2002年10月正式启动 2003年中国承担了 国际单倍型图谱计划 10 的任务 HapMap计划的目标在于 确定人类基因组中普通模式的DNA序列变异 通过测定序列变异特征 变异频率 它们之间的关联 绘出人类基因组的单倍型块 以及不同单倍型块的标记SNPs SNPs在复杂疾病研究中的现状 SNPs由于其分布广 密度高而被期望在诸如癌症 糖尿病 高血压 忧郁症和哮喘等复杂疾病的研究中起重要作用 上述疾病是多个遗传变异位点与环境因子共同作用的结果 由于发病原因复杂 涉及的基因数量多 已成为国际上疾病基因组学研究的重点 我国国家基因组南方中心已对鼻咽癌等多种疾病展开深入研究 建立了家系收集网络 取得了一定进展 国内研究者在单个基因的SNPs与疾病相关性方面进行了大量研究 如应用实时荧光技术分析N 乙酰基转移酶基因多态性与肝癌易感性的关系 结果表明 携带N 乙酰基转移酶基因慢乙酰化基因型的吸烟者可能是肝癌的高危人群 目前已有实验将SNPs应用于肿瘤预后及易感性的判断 如日本学者发现了HER