荧光定量PCR(RealTimePCR)实验原理实验设计和结果分析介绍.ppt

RealTimePCR 实时荧光定量PCR介绍 生物秀 专心做生物 主要内容 RealTimePCR基础知识RealTimePCR实验方法RealTimePCR解析方法RealTimePCR应用实例 生物秀 专心做生物 RealTimePCR基础知识 RealTimePCR的用途及原理RealTimePCR检测方法RealTimePCR检测系统 差异显示结果验证 定性分析 绝对定量 相对定量 病毒和病原菌检测 基因芯片结果验证 siRNA效果确认 mRNA表达量分析 RealTimePCR用途 操作简单 无需电泳 检测快速 降低污染几率 适用于大量样品检测 检测灵敏度高 可以在宽广范围内进行准确定量 生物品种鉴定 病毒和病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测 SNP解析 Ct值 RealTimePCR原理 使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法 RealTimePCR 生物秀 专心做生物 同一个样品重复96次PCR的扩增曲线 RealTimePCR原理 Ct值 生物秀 专心做生物 RealTimePCR扩增过程中 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 C 代表Cycle t 代表threshold Ct值概念 阈值 在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限 RealTimePCR原理 生物秀 专心做生物 在PCR反应体系中加入荧光物质 并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程 最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析 RealTimePCR原理 生物秀 专心做生物 RealTimePCR基础知识 RealTimePCR的用途及原理RealTimePCR检测方法RealTimePCR检测系统 生物秀 专心做生物 RealTimePCR检测方法 荧光染料嵌合法 SYBRGreenI 荧光探针法TaqManprobeCyclingprobeMolecularBeaconprobeHybridizationprobeScorpionsprobeAmplifluorprobe 生物秀 专心做生物 SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料 荧光染料嵌合法 SYBRGreenI SYBRGreenI 生物秀 专心做生物 荧光染料嵌合法 SYBRGreenI 作用机理示意图 热变性 引物退火 延伸反应 生物秀 专心做生物 TaqMan探针为一寡核苷酸 5 端标记一个报告荧光基团 Reporter 3 端标记一个淬灭荧光基团 Quencher TaqManProbe法作用机理 TaqManProbe法作用机理示意图 生物秀 专心做生物 Cyclingprobe为一寡核苷酸 5 端标记一个荧光报告基团 Reporter 3 端标记一个荧光淬灭基团 Quencher 寡核苷酸为DNA RNA杂合体 核糖核苷酸 CyclingProbe法 生物秀 专心做生物 热变性 酶切 延伸 CyclingProbe法基本原理 退火 SYBRGreenI法vsProbe法 SYBRGreenI法 优点 价格便宜 使用方便 无需合成特异性探针 缺点 引物要求高 要求特异性扩增 不能进行多重PCR Probe法 优点 特异性强 能进行多重PCR 缺点 需要设计特异性探针 成本高 有时设计困难 以前对PCR引物的选择 PCR试剂的优化经验不足 Probe法较为广用 但是 使用SYBRGreenI进行检测的问题点 SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光 因此如果反应体系中有非特异性扩增 非特异性DNA也将同时被检测 从而可能导致检测结果不准确 PrimerDimer的产生二条引物的3 端具有互补序列时 引物自身也会进行扩增 产生短链DNA片段 PrimerDimer 3 3 使用SYBRGreenI进行定量PCR的KeyPoint Primer 设计合适引物 防止非特异性扩增 是使用SYBRGreenI进行定量PCR的KeyPoint TaKaRa公司可以提供最佳引物的设计合成服务 RealTime进入SYBRGreenI时代 设计合适的引物选择适当的反应条件使用良好的试剂 保证以上条件 使用SYBRGreenI将会更加便宜 更为方便 并拥有良好的特异性 生物秀 专心做生物 RealTimePCR基础知识 RealTimePCR的用途及原理RealTimePCR检测方法RealTimePCR检测系统 生物秀 专心做生物 RealTimePCR检测系统 简介 LightCycler 480 Rotor gene6000 MiniOpticon Mx3005PTM LINE GENEFQD 66A ABIPRISM7500 iQ5Real TimePCRDetectionSystem TaKaRaTP800 各公司RealTimePCR检测系统比较 生物秀 专心做生物 RealTimePCR基础知识RealTimePCR实验方法RealTimePCR解析方法RealTimePCR应用实例RealTimePCR相关试剂与服务 主要内容 生物秀 专心做生物 RealTimePCR实验方法 RealTimeRT PCR反应 以RNA为起始实验材料时 RealTimePCR反应 以DNA为起始实验材料时 生物秀 专心做生物 RealTimePCR实验方法 反转录反应 OneStepRT PCR和TwoStepRT PCR的选择RTPrimer的选择TotalRNA中genomicDNA混入的对策 RealTimePCR反应 RealTimePCR引物及探针的设计引物反应性确认PCR条件优化顺序 生物秀 专心做生物 OneStepRT PCR和TwoStepRT PCR的选择 适用于mRNA表达量解析TwoStepRT PCR效率高使用Random和Oligo dT引物可以制备cDNApoolcDNA可长期保存 适用于病毒 病原菌检测操作简单污染几率低 生物秀 专心做生物 Random6merPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimer RTPrimer的选择 Random6merPrimer GenespecificPrimer OligodTPrimer 生物秀 专心做生物 RTPrimer的选择 Random6mer 1 500base 目的片段 5 3 R F 目的片段在mRNA任何位置都能使用 通常mRNA表达量分析最适 目的片段在距Poly A Tail1 5kbp以内适用 OneStepRT PCR只能使用GenespecificPrimer 不适用于mRNA表达量分析等复数基因的检出 5 3 GenespecificPrimer 目的片段 R F AAA A 5 3 目的片段 R F 1 500base OligodTPrimer 生物秀 专心做生物 mRNA PrimerF PrimerR 目的片段 RT PCR 外显子1 基因组DNA PCR 外显子2 外显子3 外显子1 外显子2 外显子3 内含子2 内含子1 PrimerF PrimerR 目的片段 TotalRNA中GenomicDNA混入的对策 此种情况必须采用DNaseI处理 去除基因组DNA 生物秀 专心做生物 mRNA 基因组DNA 目的片段 RT PCR 外显子1 外显子2 外显子3 PrimerF PrimerR PrimerF PrimerR PCR 长的扩增片段 无扩增片段 外显子1 外显子2 外显子3 内含子2 内含子1 TotalRNA中GenomicDNA混入的对策 引物设计可以避免基因组DNA来源的Template扩增 生物秀 专心做生物 目的是获得目的基因 对非特异性反应和引物二聚体要求不严格 目的是让目的基因按照理论值进行扩增 对非特异性反应和引物二聚体要求严格 RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 对引物设计要求严格 普通PCR引物 RealTimePCR引物 RealTimePCR引物及探针设计 RealTimePCR用引物设计原则 号表示重要程度 号越多 表示该参数越重要 设计时要优先考虑 生物秀 专心做生物 目的基因序列获得 好的引物需要寻找好的参照序列 引物设计 分析序列 特异性确认 基因组序列确认 RefSeq序列 目的基因 RealTimePCR引物及探针设计 RealTimeRT PCR引物 生物秀 专心做生物 http www ncbi nlm nih gov RefSeq 通过NCBI获得参考序列和相关情报 RefSeq数据库提供无重复 准确性 完整性的基因参考序列 序列可信度高 信息量大 NCBI TheNationalCenterforBiotechnologyInformation NM 008777 RefSeq 评价 Pah Pah Pah Pah X51942 BC013458 BI330290 BF789560 X51942 BC013458 BI330290 BF789560 Pah Pah GenBank RealTimePCR引物及探针设计 生物秀 专心做生物 NCBI提供目的基因相关信息 基因名 染色体上的位置 Accession 表现型 文献索引 同源性等其他数据库以及功能 passway 蛋白质图谱等 基因词典 RealTimePCR引物及探针设计 生物秀 专心做生物 LOCUSNM 0087771959bpmRNAlinearROD15 APR 2005DEFINITIONMusmusculusphenylalaninehydroxylase Pah mRNA ACCESSIONNM 008777VERSIONNM 008777 1GI 6679202SOURCEMusmusculus housemouse ORGANISMMusmusculusFEATURESLocation Qualifiersgene1 1959 gene Pah db xref GeneID 18478 db xref MGI 97473 CDS48 1409 gene Pah note go function ironionbinding goid0005506 protein id NP 032803 1 db xref GI 6679203 db xref GeneID 18478 db xref MGI 97473 ORIGIN1aattcaaccctgtgctaagctagacacctcacttactgagagccagcatggcagctgttg61tcctggagaacggagtcctgagcagaaaactctcagactttgggcaggaaacaagttaca121tcgaagacaactccaatcaaaatggtgctgtatctctgatattctcactcaaagaggaag181ttggtgccctggccaaggtcctgcgcttatttgaggagaatgagatcaacctgacacaca241ttgaatccagaccttcccgtttaaacaaagatgagtatgagtttttcacctatctggata301agcgtagcaagcccgtcctgggcagcatcatcaagagcctgaggaacgacattggtgcca361ctgtccatgagctttcccgagacaaggaaaagaacacagtgccctggttcccaaggacca421ttcaggagctggacagattcgccaatcagattctcagctatggagccgaactggatgcag481accacccaggctttaaagatcctgtgtaccgggcgagacgaaagcagtttgctgacattg541cctacaactaccgccatgggcagcccattcctcgggtggaatacacagaggaggagagga601agacctggggaacggtgttcaggactctgaaggccttgtataaaacacatgcctgctacg661agcacaaccacatcttccctcttctggaaaagtactgcggtttccgtgaagacaacatcc721cgcagctggaagatgtttctcagtttctgcagacttgtactggtttccgcctccgtcctg781ttgctggcttactgtcgtctcgagatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccact841gcacacagtacattaggcatggatctaagcccatgtacacacctgaacctgatatctgtc901atgaactcttgggacatgtgcccttgttttcagatagaagctttgcccagttttctcagg961aaattgggcttgcatcgctgggggcacctgatgagtacattgagaaactggccacaattt1021actggtttactgtggagtttgggctttgcaaggaaggagattctataaaggcatatggtg1081ctgggctcttgtcatcctttggagaattacagtactgtttatcagacaagccaaagctcc1141tgcccctggagctagagaagacagcctgccaggagtatactgtcacagagttccgacctc1201tgtactatgtggccgagagtttcaatgatgccaaggagaaagtgaggacttttgctgcca1261caatcccccggcccttctccgttcgctatgacccctacactcaaagggttgaggtcctgg1321ataatactcagcagttgaagaatttagctgactccattaatagtgaggttggaatccttt1381gccatgccctgcagaaaataaagtcatgaacagaaagtgacgtcatagacagaacttagg1441aggtcaaccaaaaaaatctgctgatagaagtatagtaactgcttcttttccctgaagaag1501aaaagttttatttgcaatgtcagcttttaatatattttcctaacatagtggaggatcacc1561aaataaatcaatttctctgaatgaaagtatattaaaacccatcagtggtagatccttcag1621agtcacatttgatttagatatctcagaccttcaatttggtttaaaatgtaatttctcagt GenBankfile NM 008777 Musmusculusphenylalaninehydroxylase Pah mRNA 目的基因序列获得 引物设计 序列分析 特异性确认 基因组序列确认 目的基因 RealTimePCR引物及探针设计 RealTimeRT PCR引物 生物秀 专心做生物 1aattcaaccctgtgctaagctagacacctcacttactgagagccagcatggcagctgttg61tcctggagaacggagtcctgagcagaaaactctcagactttgggcaggaaacaagttaca121tcgaagacaactccaatcaaaatggtgctgtatctctgatattctcactcaaagaggaag181ttggtgccctggccaaggtcctgcgcttatttgaggagaatgagatcaacctgacacaca241ttgaatccagaccttcccgtttaaacaaagatgagtatgagtttttcacctatctggata301agcgtagcaagcccgtcctgggcagcatcatcaagagcctgaggaacgacattggtgcca361ctgtccatgagctttcccgagacaaggaaaagaacacagtgccctggttcccaaggacca421ttcaggagctggacagattcgccaatcagattctcagctatggagccgaactggatgcag481accacccaggctttaaagatcctgtgtaccgggcgagacgaaagcagtttgctgacattg541cctacaactaccgccatgggcagcccattcctcgggtggaatacacagaggaggagagga601agacctggggaacggtgttcaggactctgaaggccttgtataaaacacatgcctgctacg661agcacaaccacatcttccctcttctggaaaagtactgcggtttccgtgaagacaacatcc721cgcagctggaagatgtttctcagtttctgcagacttgtactggtttccgcctccgtcctg781ttgctggcttactgtcgtctcgagatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccact841gcacacagtacattaggcatggatctaagcccatgtacacacctgaacctgatatctgtc901atgaactcttgggacatgtgcccttgttttcagatagaagctttgcccagttttctcagg961aaattgggcttgcatcgctgggggcacctgatgagtacattgagaaactggccacaattt1021actggtttactgtggagtttgggctttgcaaggaaggagattctataaaggcatatggtg1081ctgggctcttgtcatcctttggagaattacagtactgtttatcagacaagccaaagctcc1141tgcccctggagctagagaagacagcctgccaggagtatactgtcacagagttccgacctc1201tgtactatgtggccgagagtttcaatgatgccaaggagaaagtgaggacttttgctgcca1261caatcccccggcccttctccgttcgctatgacccctacactcaaagggttgaggtcctgg1321ataatactcagcagttgaagaatttagctgactccattaatagtgaggttggaatccttt1381gccatgccctgcagaaaataaagtcatgaacagaaagtgacgtcatagacagaacttagg1441aggtcaaccaaaaaaatctgctgatagaagtatagtaactgcttcttttccctgaagaag1501aaaagttttatttgcaatgtcagcttttaatatattttcctaacatagtggaggatcacc1561aaataaatcaatttctctgaatgaaagtatattaaaacccatcagtggtagatccttcag1621agtcacatttgatttagatatctcagaccttcaatttggtttaaaatgtaatttctcagt1681tctcatcaacattcatcaaatttgggactcatatcatttgggctctgtctgttcattttt CCTGGCCAAGGTCCTGCG TTGGAACCAGGGCACTGTGT AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC ACTCTTGCGACATGTGCCCTTG TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC AAAGTCATGAACAGAAAGTGA GTGATCCTCCACTATGTTAG Forward Reverse 目的基因序列获得 引物设计 序列分析 特异性确认 基因组序列确认 目的基因 RealTimePCR引物及探针设计 RealTimeRT PCR引物 生物秀 专心做生物 CCTGGCCAAGGTCCTGCG TTGGAACCAGGGCACTGTGT AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC AAAGTCATGAACAGAAAGTGA GTGATCCTCCACTATGTTAG Forward Reverse 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 SNP 3 末端的T 3bp互补 目的基因序列获得 引物设计 序列分析 特异性确认 基因组序列确认 目的基因 RealTimePCR引物及探针设计 RealTimeRT PCR引物 生物秀 专心做生物 物种选择 参考数据库 RefSeq rna WordSize 7 目的基因序列获得 引物设计 序列分析 特异性确认 基因组序列确认 目的基因 RealTimePCR引物及探针设计 RealTimeRT PCR引物 生物秀 专心做生物 AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC 5 5 3 http genome ucsc edu 目的基因序列获得 引物设计 序列分析 特异性确认 基因组序列确认 目的基因 3 RealTimePCR引物及探针设计 RealTimeRT PCR引物 生物秀 专心做生物 RealTimePCR用TaqMan探针设计原则 RealTimePCR引物及探针设计 号表示重要程度 号越多 表示该参数越重要 设计时要优先考虑 生物秀 专心做生物 TaqMan探针荧光标记物选择 RealTimePCR引物及探针设计 生物秀 专心做生物 引物反应性确认 线性关系 扩增效率确认 检测灵敏度确认 Notemplatecontrol确认 PCR扩增效率 E 0 8 1 2 35Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法 30Cycles内无非特异性产物扩增 30Cycles内无引物二聚体产生 相关系数 r2 大于0 98 生物秀 专心做生物 PCR条件优化顺序 标准Protcol95 10sec 60 20sec Primer终浓度200nM B 有非特异性扩增时提高退火温度缩短退火 延伸时间降低引物浓度 A 扩增效率低时延长退火 延伸时间提高退火 延伸温度改为三步PCR 降低退火温度提高引物浓度 生物秀 专心做生物 RealTimePCR基础知识RealTimePCR实验方法RealTimePCR解析方法RealTimePCR应用实例RealTimePCR相关试剂与服务 主要内容 生物秀 专心做生物 RealTimePCR解析方法 标准曲线分析融解曲线分析绝对定量和相对定量解析方法 生物秀 专心做生物 基线平整Negativecontrol为水平线指数区较明显 陡度大平台区汇于一起线性范围宽 理想的标准品扩增曲线 生物秀 专心做生物 标准品的种类 DNA样品定量标准品基因组DNA质粒PCR产物 RNA样品定量标准品TotalRNA cDNA体外转录RNAPCR产物或质粒 生物秀 专心做生物 绿色部分为RealTime引物区 红色部分为标准品构建用引物区 质粒标准品引物设计 质粒标准品构建 AGTACCTAGATCCTAG AGTACCTAGATCCTAG 生物秀 专心做生物 质粒标准品构建流程 基因组DNA PCR 目的基因克隆 质粒提取 OD值定量 将质粒梯度稀释至105 101copies ul 作为标准品 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 生物秀 专心做生物 绿色部分为RealTime引物区 红色部分为标准品构建用引物区 蓝色部分T7启动子和Poly T RNA标准品引物设计 生物秀 专心做生物 RNA纯化后 测OD定量 将RNA梯度稀释至105 101copies ul 作为标准品 体外转录RNA标准品构建流程 T7RNApolymerase 体外转录RNA TotalRNA PCR cDNA RT T7Promoter TTTT T PCR产物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA A AAAA A 生物秀 专心做生物 标准曲线制作 扩增曲线 106105104103102101 标准曲线 106105104103102101 标准品梯度的选择 5 6个梯度标准品稀释倍数的选择 标准品稀释倍数通常为10 生物秀 专心做生物 理想的标准曲线 相关系数 r2 大于0 98 越接近1 结果可信度越高 扩增效率 E 0 8 1 2 越接近1 越理想 相关系数 斜率 扩增效率 E 计算方法 标准曲线X轴表示起始模板浓度 log10 Y轴表示Ct值时E 10 1 a 1标准曲线X轴表示Ct值 Y轴表示起始模板浓度 log10 E 10 a 1 生物秀 专心做生物 RealTimePCR解析方法 标准曲线分析融解曲线分析绝对定量和相对定量解析方法 生物秀 专心做生物 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度 融解曲线分析 SYBRGreenI法进行检出时 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性 生物秀 专心做生物 特异性产物 非特异产物 引物二聚体 对PCR产物特异性进行分析 融解曲线分析 生物秀 专心做生物 标准曲线分析融解曲线分析绝对定量和相对定量解析方法 RealTimePCR解析方法 生物秀 专心做生物 提取样品 绝对定量解析方法 引物设计 标准品制备 RealTimePCR反应 数据分析 流程 生物秀 专心做生物 绝对定量解析方法 通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度 通常应用于病毒 细菌 衣原体 支原体的定量检测及转基因食品的检测 105 104 103 101 扩增曲线图 标准曲线图 检测样品 检测样品 102 以上条件不可能同时得到满足 必须用内对照基因 管家基因 校正 进行相对表达量分析 理论上目的基因表达量分析条件 进行相对表达量分析必要性 实际上目的基因表达量分析 生物秀 专心做生物 管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因 如 GAPDH Actin 18SrRNA等 筛选方法 根据文献提供通过具体实验筛选 管家基因筛选 生物秀 专心做生物 P P P O 管家基因筛选 生物秀 专心做生物 用实验例对相对定量计算进行说明 相对定量解析顺序 生物秀 专心做生物 相对定量解析顺序 生物秀 专心做生物 通过标准曲线对对照样品 检测样品的目的基因及管家基因进行定量 然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量 相对表达量计算 相对值 校正值 目的基因定量结果 管家基因定量结果 检测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量解析顺序 生物秀 专心做生物 RealTimePCR基础知识RealTimePCR实验方法RealTimePCR解析方法RealTimePCR应用实例RealTimePCR相关试剂与服务 主要内容 生物秀 专心做生物 RealTimePCR应用实例 定性分析对人的ALDH2基因进行SNP解析绝对定量对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析相对定量分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 检测方法CyclingProbe法SNP位点ALDH2type1和ALDH2type2 G A 使用试剂CycleavePCRCoreKitTaKaRaCode CY501使用仪器SmartCycler 实验背景Aldehydedehydrogenase 2 ALDH2 基因位于人类第12对染色体q24位置 有ALDH2type1和ALDH2type2两种基因型 其基因表现序列最主要的差别在exon12第487个氨基酸位置 ALDH2type1型为Glu GAA ALDH2type2型为Lys AAA 生物秀 专心做生物 热变性 酶切 延伸 CyclingProbe法基本原理 退火 RNaseH分解 PCR扩增产物 PCR扩增产物 PCR扩增产物 杂合探针 杂合探针 杂合探针 PCR反应 模板DNA 野生型 wildhomo 为ROX标记 突变型 mutanthomo 为FAM标记 利用Cycleave法的SNP解析原理 ROX荧光 ROX荧光 FAM荧光 FAM荧光 FAM荧光 ROX荧光 Wildhomo hetero Mutanthomo SNPpoint 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 CyclingProbe法 PCR RFLP法 ROX FAM ROX FAM通道均有信号检出 Eco57ICTGAAG N 16GACTTC N 14wildtype 切断Mutanttype 不切断 ROX FAM Mutant wild ROX通道有信号检出 FAM通道检出荧光信号 ROX FAM Mutant wild Mutant wild 杂合型 hetero 野生型 wildhomo 突变型 mutanthomo 生物秀 专心做生物 提取样品 引物 探针设计 RealTimePCR反应 数据分析 流程 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 生物秀 专心做生物 从人血液中 共计10个样品 提取基因组DNA 实验样品 提取试剂 BloodGenomeDNAExtractionKit TaKaRaCode D9081 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 生物秀 专心做生物 实验结果 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 杂合型 突变型 Sample1 Sample2 杂合型 ROX FAM同时检出 Sample6 突变型 只有FAM检出 其它Sample 野生型 只有ROX检出 生物秀 专心做生物 FAM ROX FAM ROX FAM ROX Sample1 Sample2同时检出ROX FAM Sample6只检出FAM Sample3 5 7 10只检出ROX 杂合型 突变型 野生型 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 生物秀 专心做生物 绝对定量应用例对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 检测方法TaqManTMprobe法检测样品3个从SARS病毒培养液中提取的genomeRNA目的基因SARS病毒RNA内参SARSInternalControlRNA标准品SARSControlRNA试剂OneStepRT PCRKit PerfectRealTime TaKaRaCode DRR044仪器SmartCycler 生物秀 专心做生物 pBluescriptIISK vector T7promoter SARSControlRNA构建 绝对定量应用例对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 生物秀 专心做生物 绝对定量应用例对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 纯化的SARSControlRNAOD值测定结果 体外转录的SARSControlRNA电泳照片 M1M2 M1 Hind digestM2 DL 2000Marker DNaseI处理前 DNaseI处理后 生物秀 专心做生物 DNA T7promoter SARSInternalControlRNA的构建 绝对定量应用例对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 pBluescriptIISK vector 生物秀 专心做生物 绝对定量应用例对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 体外转录的InternalcontrolRNA电泳照片 M1 Hind digestM2 DL 2000Marker 纯化的SARSInternalControlRNAOD值测定结果 M1M2 DNaseI处理前 DNaseI处理后 生物秀 专心做生物 探针的选择 绝对定量应用例对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 生物秀 专心做生物 SARSControlRNA105 101扩增曲线 SARSgenomeRNASample1 扩增曲线 SARSInternalcontrolRNA扩增曲线 标准曲线 绝对定量应用例对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 生物秀 专心做生物 定量结果 绝对定量应用例对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量 生物秀 专心做生物 检测方法SYBRGreenI荧光嵌合法管家基因GAPDH基因目的基因X基因标准品体外转录RNA试剂SYBR ExScriptTMRT PCRKit PerfectRealTime TaKaRaCodeNo DRR053仪器Line Gene33 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 样品 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 TotalRNA提取 TotalRNA基因组DNA去除 标准品RNA制备 标准曲线制作及预实验 详细的实验资料获取 实验设计及引物设计 合成 样品RealTimePCR反应 相对定量计算及数据分析 数据整理及论文撰写 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 提取TotalRNA去除基因组DNA后电泳照片 RNA纯度 1 8 260 280 2 3 提取试剂 TaKaRaRNAisoReagentTaKaRaCodeD312 基因组DNA去除试剂 DNaseI RNaseFree TaKaRaCodeD2215 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 构建RNA标准品电泳照片 MGAPDHX基因 TaKaRainVitroTranscriptionT7Kit TaKaRaCodeD6140 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 目的基因标准曲线制作结果 扩增曲线图 融解曲线图 标准曲线图 管家基因标准曲线制作结果 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 样品目的基因定量结果 扩增曲线图 融解曲线图 样品管家基因定量结果 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 由以上结果显示小鼠某基因经药物处理6小时时表达量最高 相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 生物秀 专心做生物 RealTimePCR基础知识RealTimePCR实验方法RealTimePCR解析方法RealTimePCR应用实例RealTimePCR相关试剂与服务 主要内容 生物秀 专心做生物 RealTimePCR相关试剂的选择 试剂选择的要素TaKaRaPerfectRealTime相关试剂在各种仪器上的适用性TaKaRaPerfectRealTime相关试剂与其它公司同类产品的比较TaKaRaPerfectRealTime相关系列产品特点TaKaRaRealTime相关试剂的选择 生物秀 专心做生物 使用方便性 2 Premixtype 无需反应条件摸索 高扩增效率 可以检测低拷贝DNA模板 高反应特异性 可在宽广范围内进行准确定量 与RealTimePCR检测系统的匹配性 选择适用于各种RealTimePCR检测系统的试剂 价格因素 降低实验成本 试剂选择的要素 生物秀 专心做生物 定量范围宽广 扩增效率高 起峰时间早 低拷贝检测清晰 反应特异性高 负对照扩增稳定 无非特异性扩增 间隔距离均匀 信号强度高 试剂选择的要素 生物秀 专心做生物 实验项目以 DNA 1fg 10fg 100fg 1pg 10pg 100pg 1ng 为模板 进行300bp扩增性能及扩增特异性检测 试剂名称SYBR PremixExTaqTM PerfectRealTime CodeNo DRR041 TaKaRaPerfectRealTime相关试剂在各种仪器上的适用性 SmartCycler ABI7000LightCycler2 0Rotor Gene2000 使用仪器 生物秀 专心做生物 增幅效率 1 02相关系数 1 000 StandardCurve取7点 增幅效率 0 99相关系数 0 999 StandardCurve取7点 实验结果 ABIPRISM7000 Lightcycler2 0 Rotor gene2000 SmartCyclerII Ver 2 0C 增幅效率 1 02 相关系数 0 999 Standcurve取7个点 增幅效率 1 03相关系数 1 000 StandardCurve取7点 TaKaRaPerfectRealTime相关试剂在各种仪器上的适用性