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高级动物生理学专题之四血液凝固研究进展 血液凝固是指血液由液体状态变成不能流动的凝胶状态的过程 经典的血液凝固学说提出 内源性凝血途径和外源性凝血途径 外在途径起辅助作用 现今的血液凝固两阶段学说 强调体内凝血过程主要是由组织因子途径启动的 之后通过微量凝血酶的放大效应导致凝血 并强调两途径的密切联系和相互作用 血浆与组织中直接参与血液凝固的物质 称为凝血因子 根据其发现的先后顺序 由国际凝血因子命名委员会以罗马数字编号命名 共有13种 即凝血因子 其中因子 是因子 的活性形式 后被删除 一 凝血因子 血液凝血因子 除钙离子与磷脂以外 其余已知的凝血因子都是蛋白质 绝大多数是蛋白酶 它们在血液中都是以无活性的酶原形式存在 必须通过其他酶的水解作用才具有酶的活性 习惯上在该因子代号的右下角标上 a 如Inactive F 被激活为Active a F a 二 经典凝血学说及其存在问题 一 经典凝血学说是20世纪60年代Macfarlane Davie和Ratnoff分别提出并逐步完善的 瀑布学说 凝血过程分为三个阶段第一阶段 凝血酶原激活物 Xa Va PL Ca 形成阶段 内源性和外源性途径 第二阶段 凝血酶的形成阶段第三阶段 纤维蛋白形成阶段 1 IntrinsicPathway是指参与凝血的全部凝血因子都来自血液的凝血途径 其触发是由于血液与带有负电荷的表面相接触 BloodVesselInjury IX IXa XI XIa X Xa XII XIIa a Fibrinogen Fibrinmonomer XIII 内源性凝血途径 PK K 胶原 异物 Ca2 VIIIPF3Ca2 VPF3Ca2 2 外源性凝血途径是指凝血的组织因子 组织凝血激酶 因子 是来自组织 而不是来自血液的凝血途径 故又称为凝血组织因子途径 Xa a Fibrinogen Fibrinmonomer XIII TissueInjury TissueFactor Thromboplastin VIIa VII X 外源性凝血途径 VPF3Ca2 Ca2 二 经典凝血学说存在的问题 1 内在途径不能解释的临床问题 如 接触因子 高分子激肽原 前激肽释放酶 PK 缺陷患者没有出血倾向 迄今没有发现天然的生理性带负电荷表面接触激活物 接触因子 PK与高分子激肽原 HMWK 纯合子缺陷患者不仅没有出血倾向 反而存在血栓倾向等 表明接触因子 前肌肽释放酶和高分子肌肽原并不是参与机体生理性止血的凝血因子 而外源性凝血途径在生理性止血过程的启动中起关键作用 其启动物是组织因子 且由于其镶嵌于细胞膜上 也有利于凝血过程局限于受损血管的局部 2 与内源凝血途径有矛盾的实验现象激肽释放酶原 PK 转化为激肽释放酶 K 后 用接触因子 的抗体耗竭体内的 之后注射内毒素 仍然可以引起动物发生弥散性血管内凝血 但内毒素所致的休克和炎症反应减轻 故可以认为内毒素引起DIC disseminatedintravascularcoagulation 与接触激活没有明显相关性 内毒素所致的接触激活主要与炎症反应和血压降低 补体活化产生的C5a是一个较强的致炎物质 缓激肽作用 有关 3 外在途径不能解释的问题 既然外在途径可以直接激活F 为何不能生成足够的F a以弥补内在途径因子缺陷 后来发现血浆中存在组织因子途经抑制物TFPI 组织因子是一种存在于多种细胞质膜的一种特殊跨膜糖蛋白 生理状态下它不出现于血液中 当组织受损时 损伤处细胞膜的组织因子将很快与F 结合 而启动外在途径 但由于TFPI对F a和F a TF的灭活作用 外在途径只能生成少量的凝血酶 且作用短暂 二 血液凝固的现代学说 20世纪90年代由Davie和Broze等对经典学说进行了修正 即现在较为公认的 凝血过程两阶段学说 观点 1 体内凝血过程几乎都是由外在途径启动的 F a TF复合物在磷脂表面和Ca 存在下 激活FX F 从而启动凝血过程 1993年国际血栓与止血学术学会将外在途经更名为组织因子途径 但由于TFPI的存在 启动阶段只形成微量的凝血酶 2 放大阶段微量的凝血酶通过以下四个环节产生放大效应 凝血酶激活血小板 使其暴露其带有负电荷的内层磷脂 利于多种凝血因子的附着与催化作用 在磷脂存在下 凝血酶激活FXI FXIa激活FIXa 加速凝血过程 凝血酶激活F F a FIXa Ca 和磷脂表面形成复合物 高速催化FX的激活 凝血酶激活FV FVa在磷脂表面作为FVa受体与FVa结合 从而避免了TFPI和抗凝血酶 对它的灭活 于是在磷脂表面形成高效的凝血酶原酶激活物 3 组织因子途径是否均通过两个阶段 取决于与血液接触组织因子的数量 1 数量低 须经上述两阶段2 数量高 将主要依靠组织因子途径促进血凝 凝血过程的现代概念示意图 Ca Ca Ca Ca 三 组织因子途径的组成与活性 一 组织因子组织因子是一种糖蛋白 是一种跨膜蛋白 有263个氨基酸残基组成 在生理条件下 除了与血液直接接触的血细胞和血管内皮细胞外 其余大部分组织细胞均表达组织因子 组织因子的功能 1 功能上是FVIIa与FVII的受体 又是FVIIa激活FX FIX的必需辅助因子 即FVII只有与TF结合才能激活成为FVIIa 而FVIIa只有与TF结合才能激活FX FIX 以上结合过程不但需要Ca 的参与 而且在磷脂表面存在的条件下 其对FX FIX的激活过程加快数千倍 2 组织因子的膜外区对纤溶过程具有调节作用 3 TF的表达与胚胎发育 尤其是血管的发育有关 TF基因缺失的小鼠 由于胚胎血管发育不全 在9 10天常因大出血而死亡 二 因子VII 是一种维生素K依赖因子 由肝脏合成 有406个氨基酸组成 为一单链的酶原 在全部凝血因子中 的半衰期最短 因此急性肝功能衰竭的病人将很快出现 的缺乏 因子VII的激活以FXa FIXa为主 FVIIa本身也有自身激活作用 FXa FIXa的这种正反馈作用使得VIIa快速大量的生成 利于组织因子途径发挥启动凝血的作用 随后FVIIa TF与Ca 磷脂存在时立即进一步以更快的速度激活FX 三 磷脂与FVIIa TF FVIIa与TF的结合不需要磷脂的参与 但是磷脂酰丝氨酸能明显提高FVII和FVIIa与TF结合的数量与质量 形成的FVIIa TF只有装配在磷脂表面才能够更加高效的激活FX与FXI 四 组织因子途径的负性调控 一 组织因子途经抑制物 tissuefactorpathwayinhibitor TFPI 是一种天然的 主要由血管内皮细胞合成的体内抗凝蛋白 它对于组织因子途径具有特异性的抑制作用 它以多种形式存在于血浆中 但仅约5 10 呈游离状态 结构特点 羧基端有多个谷氨酸 与Ca 和磷脂的结合有关 氨基端有多个碱性氨基酸 与肝素和脂蛋白的结合有关 二 TFPI 2一种新发现的抗凝蛋白 氨基酸序列与TFPI相似 主要由血管内皮细胞合成 肝脏和胎盘也可以合成 作用 对于FXa无抑制作用 但能直接抑制FVIIa TF的催化活性 对于FXIa和纤溶酶也有一定抑制作用 三 抗凝血酶 主要功能是灭活FXa a a a等 在肝素的存在时 还可以灭活FVIIa TF 四 其它凝血因子 一 凝血因子 因子 是一种无活性的丝氨酸蛋白水解酶 可以被带有负电荷的表面所吸附 被多种因子激活 如激肽释放酶 因子 a XIa和纤维蛋白溶解酶 内源性激活主要靠激肽释放酶 活化产物有两种 a a 它们均能够激活激肽释放酶原 但只有 a才能激活XI 二 XI因子 XI因子在血浆中与高分子激肽原以非共价键形式结合存在于血浆 可以被XIa a和 a激活为XIa 高分子激肽原结合位点 游离XI结合位点 XIa a和 a作用部位 因子 的激活过程 XI XIa 三 激肽释放酶原和激肽原 1 激肽释放酶原在 a催化下从精氨酸 异亮氨酸肽键处切断肽链 形成一个含有高分子激肽原结合区的重链和一个具有激肽释放酶活性的轻链 HMW K结合区 2 激肽原人体血液中有两种激肽原 HMW K和LMW K 作用不祥 HMW K是单链糖蛋白 在接触时相中可以作为 和激肽释放酶原激活过程的辅助因子 也可以作为激肽释放酶的底物而被激活 也可以被激活的 a在其lys380 Arg381和Arg 389 Ser 390 之间裂解 从而生成不含缓激肽的双链分子 它可以带有负电荷的表面结合而将PK和 带到异物表面 使其被 a激活 缓激肽 四 因子 人的因子 是单链糖蛋白分子 由415个Aa构成 由肝细胞合成 其过程需要维生素K 遗传缺乏此因子的疾病 为B型血友病 其激活途径主要有2个 被内源性途径的 a所激活 通过外源性途径的组织因子 a所激活 此外也可以被 a Ca 和磷脂的复合物缓慢激活 a的功能为 与 a Ca 和磷脂等相互作用形成 因子激活复合物 以激活X因子 五 因子 抗血友病因子A 抗血友病蛋白 也称为血小板辅助因子 典型的血友病患者血液中缺乏 因子 表现出严重的出血症状 多为男性发病x性联隐性遗传 它与临床另一种常见的遗传性出血性疾病 VonWillebrand病不同 一种常染色体显性遗传病 也表现为 因子活性减低 但其特征是缺少另外一种蛋白质 即vWF因子 1 的激活与作用 a a 显著增强 a对 的活化作用 即参与凝血过程 2 vWF含有胶原和血小板膜糖蛋白的结合位点 故可以在血小板黏附过程中起作用 参与原发性止血 也可以通过与 a结合成复合物 保护其免受蛋白酶水解 从而在凝血过程中起辅助作用 六 组织因子和 因子 1 组织因子又称为 因子 是位于多种细胞表面的不具有蛋白水解酶活性的蛋白组分 脱辅基蛋白 与几种磷脂 胆固醇构成的脂蛋白复合物 故外源性途径凝血酶原激活物的形成不需要来自血小板的磷脂表面 2 因子是一单链糖蛋白 氨基端含有 羧基谷氨酸残基 具有结合Ca 和磷脂表面的功能 羧基端具有丝氨酸蛋白酶活性 因子可以被Xa激活而转化成 a 1 可以与组织因子结合启动外源性凝血 2 在组织因子 Ca 同时存在时激活 此过程可以被内 外源途径的 a a a a等所促进 3 因子 组织因子复合物在Ca 存在时 二者以1 1结合 具有 1 加速蛋白水解酶对 因子的激活过程 2 加强 a对 的活化 七 X因子和 因子1 X因子有两条多肽链 重链 轻链 通过二硫键连接组成 轻链有Ca 和磷脂的结合部位 重链有酶活性部位 2 因子又称为加速因子 可以使Xa对凝血酶原的活化速度提高278000倍 缺乏Va Xa不能导致凝血 因子是单链糖蛋白 有三个不同的结构域组成 包括3个A区 一个B区和3个C区 A1 A2 B A3 C1 C2 C3 因子的活化是通过Xa因子作用于位于709 1018 1545位的精氨酸所形成的肽键 形成由Ca 以非共价键结合的两个肽链 重链 轻链 即 a因子 八 凝血酶原 凝血酶原是单链糖蛋白约含有600个氨基酸残基 有3个寡糖链 有四个酶切位点 切点或切点次序不同 可出现多种不同产物 凝血酶原肽链的N末端含有10个 羧基谷氨酸残基 相邻的羧基可与Ca 形成复合体 而Ca 可与磷脂表面中磷酸基结合 这样使Xa和Va与凝血酶原接触在一起 于是Xa将凝血酶原水解为凝血酶 每分子凝血酶原结合4个Ca 维生素K是形成凝血酶上Ca 结合部位 羧基谷氨酸所必需 图10 5因子Xa激活凝血酶原示意图 九 纤维蛋白原 人和脊椎动物的纤维蛋白原分子均由 三对不同的多肽链借二硫键连接而成 及 肽链的N 端分别有一段16个及14个氨基酸的小肽 称为纤维肽A及B 国际血液凝固命名学会建议 纤维蛋白原的分子组成表示为A 2B 2 2 链有610个氨基酸 链有461个氨基酸 链有411个氨基酸 纤维蛋白比纤维蛋白原缺少纤维蛋白肽A和B 图4 10纤维素蛋白原分子示意图 上半为电镜下的分子形状下半示6条多肽链 一为双硫键 为凝血酶作用点 凝血酶的本质为一种蛋白水解酶 能特异性作用于A 和B 链上的精 甘肽键 切除A B纤维肽 因纤维肽A及B均为酸性肽 带较多负电荷 由于电荷排斥作用阻碍纤维蛋白原之间聚合 切除纤维肽A及B转变为纤维蛋白后负性减小 同时暴露了互补结合位点 有利于自动聚合 纤维蛋白单位通过边靠边 端靠端的聚合形成聚合链 此种多聚体不稳定 称为软凝块 softclot 它再通过因子X a的作用结成牢固的网 十 纤维蛋白稳定因子 因子X a称为纤维蛋白稳定因子 fibrinstabilizingfactor FSF 因子X 存在于血小板及血浆中 经凝血酶切除部分肽段后裂解为两个亚单位