骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究ppt课件.pptVIP

骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究 天马行空官方博客 一 研究背景 天马行空官方博客 心肌病 难治性心力衰竭等心血管疾病仍严重威胁着人类的生命 各种心肌疾病 心肌缺血 坏死 有功能的心肌细胞 心肌组织 纤维组织增生 取代 形成瘢痕组织 进行性的心收缩功能不良 心腔扩张和心力衰竭 内科治疗 不能替代坏死心肌 心脏移植 供体少 费用高 难以推广细胞移植 带来了新的曙光 骨髓间充质干细胞 MSC 分化 1 心肌细胞 2 内皮细胞 3 平滑肌细胞 优点 1 自体移植 不存在免疫排斥问题 2 MSCs定向分化的能力较强 3 来源广 容易获取 4 不存在伦理道德上的争议 现有的研究已证实 MSCs移植 减少梗死面积改善心功能增加新生血管形成 二 研究目的 分离纯化骨髓间充质干细胞 探讨骨髓间充质干细胞移植对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心功能的影响 三 材料与方法 动物 具有同基因背景的近交系F344大鼠药品及试剂 注射用盐酸阿霉素 淋巴细胞分离液 胎牛血清 低糖DMEM培养基 胰蛋白酶 5 溴 2 脱氧尿苷 BrdU 小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体 SP法试剂盒 浓缩型DAB试剂盒 小鼠抗大鼠单抗CD11b c FITC CD34 FITC CD44 PE和CD90 PE 以及相应同型对照单抗小鼠IgG1 FITC IgG1 PE IgG2a PE和IgG2a FITC等设备及器械 BCM 1000型生物洁净工作台 37 恒温CO2培养箱 倒置相差显微镜 70 超低温冰箱 LXJ 离心机 RM6240型生物信号采集分析系统 YP100型压力换能器 流式细胞仪等 实验路线1 细胞部分 实验路线2 动物实验 F344大鼠 ADR注射 细胞移植组 心功测定 组化分析 细胞移植 DMEM注射 移植对照组 NS注射 F344大鼠 正常对照组 一 实验动物分组及心力衰竭模型建立 1 随机选取10只大鼠作为正常对照组 NS腹腔注射 2 其余36只大鼠 采用腹腔注射阿霉素 2mg kg 每周一次 共六次 建立心力衰竭模型3 存活大鼠再随机分为2组 移植对照组 细胞移植组 二 MSCs的分离及培养 1 将F344大鼠处 无菌条件下获取股骨和胫骨 用培养液冲洗骨髓腔 获取全部骨髓细胞2 采用淋巴细胞分离液进行分离纯化3 细胞以1 104 cm2的密度接种于培养瓶 置培养箱内培养4 48h后首次换液 以后约3 4天换液一次5 待细胞生长至铺满瓶壁的2 3以上时 进行消化 传代 三 MSCs的鉴定 1 倒置显微镜下观察MSCs的形态 2 MSCs的流式细胞仪鉴定 检测MSCs细胞表面抗原CD11b c CD34 CD44和CD90的表达第3代MSCs消化离心洗涤滤过一抗孵育离心洗涤上机检测 四 MSCs的标记 1 BrdU储存液的配制 将10mgBrdU 0 8mL二甲基亚砜和1 2mL蒸馏水充分混匀 4 避光保存 2 移植前 待细胞达到50 融合时 在细胞培养瓶内加入上述BrdU液 终浓度调至50mg L 于37 含5 的CO2的饱和湿度培养箱内继续培养48h 五 MSCs的BrdU标记率检测 第3代MSCs 细胞爬片 BrdU孵育48h PBS 甲醛固定 3 H2O2灭活内源性酶 酸变性 胰酶修复 非免疫血清封闭液 PBS 阴性对照 一抗1 200 生物素化二抗 SABC DAB显色 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 PBS PBS PBS PBS 苏木素复染 阴性对照 PBS 蒸馏水 六 MSCs移植 1 细胞移植组 大鼠腹腔阿霉素末次注射后1周 将标记好的MSCs50 l 细胞数3 106 从股静脉缓慢注入 2 移植对照组 股静脉缓慢注入DMEM培养基50 l 3 正常组不做任何处理 七 大鼠心功能的测定 仪器准备 参数调节 大鼠麻醉 固定 去毛 切开皮肤 手术分离右颈总动脉 插入自制心导管 缓慢推进至左心室 稳定后测量LVSP LVDP HR及 dP dtmax 八 MSCs移植后的心脏归巢检测 心脏甲醛固定 酒精脱水 石蜡包埋 切片脱蜡 水化 3 H2O2灭活内源性酶 酸变性 胰酶修复 非免疫血清封闭液 PBS 阴性对照 一抗1 200 生物素化二抗 SABC DAB显色 蒸馏水 蒸馏水 PBS PBS PBS PBS 固绿复染 PBS 蒸馏水 透明封片 九 统计分析 所得的数据用均数 标准差 mean SD 表示SPSS10 0统计软件处理数据多个样本均数比较采用oneway ANOVA检验P 0 05表示有显著性差异 四 结果 MSCs贴壁生长示意图 其余结果略 呵呵 五 讨论 心肌损伤 舒缩功能障碍 心力衰竭 阿霉素心肌损害机制 阿霉素诱导的心衰模型成功构建判定指标 行为表现 肝淤血 心功能 LVSP LVEP dP dtmax 本研究发现从开始腹腔注射阿霉素第2周起 造模组大鼠即开始出现程度不等的中毒症状 表现为精神委靡 腹泻 皮毛松软失去光泽 活动 进食减少 体重减轻等大鼠断头处死之后发现 造模组大鼠均有不同称度的肝淤血 胸腔积液及粘连 MSCs的分离和纯化方法 贴壁筛选法 密度梯度离心法 免疫分选法 MSCs的鉴定 MSCs的表型不均一 分别具有间充质细胞 上皮细胞和内皮细胞的特点 MSCs阳性表达的抗原 SB 10 SH 2 SH 3 SH 4 CD29 CD44 CD71 CD90 CD106 CD120a和CD124等 MSCs阴性表达的抗原 CD1a CD11b c CD31 CD34 CD14 CD45 CD56 ESA等 本研究选用了CD11b c CD34 CD44 CD90表面抗原对MSCs进行表型鉴定CD11b c为巨嗜细胞表型 CD34为造血细胞表型结果证实MSCs不表达CD11b c和CD34而表达CD44和CD90 MSCs的移植途径 局部直接注入 直视下心肌内直接注射 经导管冠状动脉内注射及经导管心肌内直接注射全身注入 MSCs的归巢 homing 功能 Orlic 细胞 梗死心肌周围 天后 原坏死心肌的68 Kocher 细胞 尾静脉注入 周后 坏死心肌上出现移植细胞分化的内皮细胞 MSCs移植改善心功能的机制 移植的干细胞分化形成了新的心肌细胞和血管移植的细胞维持了受损心肌的相对完整性移植的细胞分泌某些血管生成因子 生长因子 细胞因子等物质干细胞激发某种化学反应 改善局部细胞的功能 展望 一系列基础及临床研究均获得了振奋人心的结果随着基础 临床研究的继续开展 尚存的诸多难题将得以一一解决MSCs移植有望成为心肌病 难治性心力衰竭的一种有效治疗方法 六 结论 采用腹腔注射阿霉素 可成功复制阿霉素诱导的心力衰竭大鼠模型 体外培养的第三代骨髓间充质干细胞均一表达CD44和CD90 不表达CD11b c和CD34 骨髓间充质干细胞移植后4周 在受体大鼠的心脏上可发现移植的细胞存活 骨髓间充质干细胞移植可明显改善阿霉素诱导的心力衰竭大鼠的心功能 七 致谢 本课题是在林明教授和谢良