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食品生物技术精品课程 主讲 刘常金 第一章蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础 自从1953年F Sanger测定了胰岛素的一级结构以来 现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定 x 1 样品必需纯 97 以上 2 已知蛋白质的分子量 3 测定蛋白质由几个亚基组成 4 测定蛋白质的氨基酸组成 并根据分子量计算每种氨基酸的个数 1 测定蛋白质一级结构的要求 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质样品摩尔数之间的关系 即可确定多肽链的数目 测定蛋白质分子中多肽链的数目 酸水解 常用6mol L的盐酸在105 110 条件下进行水解 反应时间约20小时 缺点是色氨酸被沸酸完全破坏 含有羟基的氨基酸丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸有一小部分被分解 天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基 酰氨基总量可由水解液中的氨量算出 蛋白质分子的氨基酸组成分析 色氨酸分析 碱水解 一般用5mol L氢氧化钠煮沸10 20小时 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏 产率不高 部分的水解产物发生消旋化 色氨酸在水解中不受破坏 羟基氨基酸的测定 水解中氨基酸遭破坏的程度与保温时间有线性关系 水解过程中遭破坏的氨基酸的真实含量可通过在不同保温时间测出样品中该氨基酸的含量并外推至零时间的方法求出 1 多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子 必须先进行拆分 蛋白质一级结构的测定 肌红蛋白 血红蛋白 2 蛋白质一级结构的测定步骤 非共价键连接的破坏几条多肽链借助非共价键连接在一起 称为寡聚蛋白质 如 血红蛋白为四聚体 烯醇化酶为二聚体 可用8mol L尿素或6mol L盐酸胍处理 即可分开多肽链 亚基 蛋白质一级结构的测定 二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起 可在8mol L尿素或6mol L盐酸胍存在下 用过量的 巯基乙醇处理 使二硫键还原为巯基 然后用烷基化试剂如碘乙酸保护生成的巯基 以防止它重新被氧化 蛋白质一级结构的测定 2 分析多肽链的N 末端和C 末端 蛋白质一级结构的测定 多肽链端基氨基酸分为两类 N 端氨基酸 amino terminal 和C 端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中 最重要的是N 端氨基酸分析法 末端基氨基酸测定 Sanger法 2 4 二硝基氟苯在碱性条件下 能够与肽链N 端的游离氨基作用 生成二硝基苯衍生物 DNP 在酸性条件下水解 得到黄色DNP 氨基酸 该产物能够用乙醚抽提分离 不同的DNP 氨基酸可以用色谱法进行鉴定 末端基氨基酸测定 二硝基氟苯 DNFB 法 N 端氨基酸的测定 在碱性条件下 丹磺酰氯 二甲氨基萘磺酰氯 可以与N 端氨基酸的游离氨基作用 得到丹磺酰 氨基酸 此法的优点是丹磺酰 氨基酸有很强的荧光性质 检测灵敏度可以达到1 10 9mol 末端基氨基酸测定 丹磺酰氯法 多肽或蛋白质的末端氨基酸与PITC作用生成苯氨基硫甲酰多肽或氨基酸 PTC 氨基酸 在酸性有机溶剂中加热时 N 端PTC 氨基酸发生环化生成PTH 氨基酸从肽链上掉下来 PTH 氨基酸用有机溶剂抽提干燥后 可用TLC 气相色谱 高效液相色谱等方法进行鉴定 此原理也用在肽段的氨基酸顺序测定上 末端基氨基酸测定 苯异硫氰酸酯法 PITC法 氨肽酶是一种肽链外切酶 它能从多肽链的N 端逐个的向里水解 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量 按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线 从而知道蛋白质的N 末端残基顺序 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以亮氨酸残基为N 末端的肽键速度最大 末端基氨基酸测定 氨肽酶法 此法是多肽链C 端氨基酸分析法 多肽与肼在无水条件下加热 C 端氨基酸即从肽链上解离出来 其余的氨基酸则变成肼化物 肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C 端氨基酸分离 末端基氨基酸测定 肼解法 C 端氨基酸的测定 羧肽酶是一种肽链外切酶 它能从多肽链的C 端逐个的水解 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量 从而知道蛋白质的C 末端残基顺序 目前常用的羧肽酶有四种 A B C和Y A和B来自胰脏 C来自柑桔叶 Y来自面包酵母 羧肽酶A能水解除Pro Arg和Lys以外的所有C 末端氨基酸残基 B只能水解Arg和Lys为C 末端残基的肽键 末端基氨基酸测定 羧肽酶法 3 多肽链的断裂和分离可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片 并将其分离开来 蛋白质一级结构的测定 裂解要求 断裂点少 专一性强 反应产率高 酶解法 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶 proteolyticenzyme 或称蛋白酶 proteinase 已有十多种 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸 也不会发生消旋化 水解的产物为较小的肽段 最常见的蛋白水解酶有以下几种 胰蛋白酶 糜蛋白酶 胃蛋白酶 嗜热菌蛋白酶 多肽链的选择性降解 Trypsin R1 赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链 专一性较强 水解速度快 肽链 水解位点 胰蛋白酶 减少trypsin的作用位点 马来酸酐修饰Lys残基1 2 环己二酮修饰Arg残基增加trypsin的作用位点 氮丙啶修饰Cys残基侧链成为类似Lys的侧链使trypsin能断裂Cys羧基侧的肽键 或胰凝乳蛋白酶 Chymotrypsin R1 苯丙氨酸Phe 色氨酸Trp 酪氨酸Tyr 亮氨酸Leu 蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢 肽链 水解位点 糜蛋白酶 Pepsin R1和R2 疏水性氨基酸 R1 苯丙氨酸Phe 色氨酸Trp 酪氨酸Tyr 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快 作用pH为2 二硫键在酸性条件下稳定 常用于二硫键位置的确定中 肽链 水解位点 胃蛋白酶 化学法 Cyanogenbromide 溴化氰水解法 它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键 多肽链的选择性降解 4 测定每个肽段的氨基酸顺序 蛋白质一级结构的测定 Edman 苯异硫氰酸酯法 氨基酸顺序分析法实际上也是一种N 端分析法 此法的特点是能够不断重复循环 将肽链N 端氨基酸残基逐一进行标记和解离 Edman氨基酸顺序分析法 2 一般测定步骤 5 确定肽段在多肽链中的次序 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠 拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序 蛋白质一级结构的测定 2 一般测定步骤 6 确定原多肽链中二硫键的位置 蛋白质一级结构的测定 一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 再利用对角线电泳技术分离出各个肽段 将每个肽段进行组成及顺序分析 然后同其它方法分析的肽段进行比较 确定二硫键的位置 二硫键位置的确定 7 修饰氨基酸残基的定位 1 磷酸化修饰定位 用质谱法 ESI或MALDI 比较碱性磷酸酶去磷酸化前和后的肽段质谱可以定位磷酸化位点2 糖基化位点的确定比较用糖苷酶水解前和后的肽段的质谱 基质辅助的激光解析离子化MALDI 可以定位糖基化位点 第二节质谱法测定肽链一级结构 质谱技术已有100多年的历史 但生物质谱仪的诞生是近20年的事情 生物质谱仪的诞生为蛋白质和多肽的结构分析提供了重要的手段 质谱技术的基本原理 质谱 MassSpectrometry 是带电原子 分子或分子碎片按质核比 m z 的大小顺序排列的图谱 质谱仪两个核心部件 离子源 质量分析器离子源的发展史也就是质谱仪的发展史 生物质谱仪 由于生物样品极不稳定 传统离子源 EI CI 不能用来电离生物样品 20世纪80年代末 软电离离子源ESI 电喷雾电离 和MALDI 基质辅助激光解析电离 的出现 使质谱技术成为了现代蛋白科学中最重要和不可缺少的研究手段 市场上出售的生物质谱仪 ESI MS MALDI TOF MS等 生物质谱在蛋白质或多肽序列测定中的应用 1 分子量的测定分子量是蛋白质 多肽最基本的物理参数 分子量是基因工程产品报批的重要数据之一 生物质谱测定的蛋白质分子量高达40万 精确度高达0 1 0 001 远远高于目前常规应用的SDS PAGE电泳与高效凝胶色谱技术等 2 肽谱测定 PMF 是对蛋白质酶解或降解后所得到的多肽混合物进行质谱分析的方法 对质谱分析所得肽端与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽段进行比较 从而判断所测蛋白质是已知还是未知 肽谱是生物制药企业鉴定生物技术药物的常用手段 3 肽 蛋白质序列测定技术随着生物质谱技术的发展 用MS测定蛋白质序列越来越被人们重视 串联质谱技术可直接测定肽段的氨基酸序列 一级质谱产生的肽段进入二级质谱 肽段沿肽健继续断裂 由所得到的肽段质量数结合数据库查询确定肽段序列 这就是肽序列标签技术 PST 4 巯基和二硫键定位利用碘乙酰胺 2 硫苏糖醇等试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化 结合蛋白酶切 肽谱技术 利用生物质谱的准确分子量测定 可实现对二硫键和自由巯基的快速定位和确定 5 蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后会根据不同功能要求发生20多类修饰 其中最常见的是磷酸化和糖基化 这些修饰将极大影响其生物活性 串联质谱的离子扫描模式可以快速选择被修饰片段 然后根据特征丢失确定修饰类型 是目前最有效的对蛋白质翻译后修饰进行识别和鉴定的分析手段 6 蛋白质组研究双向电泳获得大量蛋白质点需要鉴定 只有质谱技术才能满足这样的要求 质谱技术是蛋白质组研究的三大支撑技术 双向电泳技术 质谱技术 蛋白质数据库 之一 蛋白质是一类非常有用的物质例如 酶是催化化学反应的蛋白质 抗体起到防护的作用 角蛋白或胶原蛋白用于稳定结构 激素用于传递信号 作为电子传递及氧输送的载体 从生态角度 蛋白质也是非常理想的物质 它的生物合成不需要消耗很多能量 它的专一性非常强 不会产生副作用并且能很快降解 一 概述 到目前为止蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用 其原因是与化学试剂比较 蛋白质的分子量是非常大的 通常在10000到1000000之间 因此它们之中的大多数不能通过化学方法生产 在进化过程中蛋白质的功能是在生理条件下发挥的 在其他条件 如在有机溶剂中它是不稳定的 另外专一性很强是蛋白质一大优点 但从另一角度它的应用范围却受到影响 这又是它的缺点 分子生物学的迅速发展很快克服了上述缺点或不足 特别是定位突变及PCR 聚合酶链式反应 使得蛋白质可能工程化 蛋白质工程与蛋白质设计的术语是20世纪80年代初产生的 通过序列修饰改造改变蛋白质的性质并有应用价值的第一个报道引起了人们广泛的关注 纷纷成立了蛋白质工程及设计的专门机构 尽管通过蛋白质工程研究已取得许多激动人心的成果 但是通过蛋白质设计产生一个结构确定 具有新的所希望性质的稳定的新蛋白质并不容易 公开性蛋白质的研究组织 蛋白质设计的目的一是为蛋白质工程提供指导性信息 二是探索蛋白质的折叠机理 蛋白质设计分为基于天然蛋白质结构的分子设计及全新蛋白质设计或蛋白质从头设计 简单蛋白质建筑或骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径 也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律 蛋白质设计目前存在的问题设计的蛋白质与天然蛋白质比较 缺乏结构的独特性及明显的功能优越性 所有设计的蛋白质有正确的形貌 显著的二级结构及合理的热力学稳定性 但一般说来它们的三级结构的确定性较差 从图2 1 a 看出 大然蛋白质有确定主链结构及侧链构象 图2 1 b 所示的设计蛋白质的结构是一组低能构象的集合 缺乏结构独特性 蛋白质设计是一门新兴的研究领域 其本身在不断地发展 其内容也在不断地更新 蛋白质设计及结构与功能关系研究的必要性 蛋白质设计是多学科的交叉领域 蛋白质设计在许多方面取得的显著进展 第一节基于天然蛋白质结构的分子设计 一 概述蛋白质结构与功能的关系的认识对蛋白质设计是至关重要的 蛋白质的结构涉及一级结构 序列 及三维结构 即使蛋白质的三维结构是已知的 选择一个合适的突变体仍是困难的 这说明蛋白质设计任务的艰巨性 它涉及多种学科的配合 如计算机模拟专家 X射线晶体学家 蛋白质化学家 生物技术专家等的合作与配合 计算机模拟 基因构建 突变蛋白质产品 功能分析 蛋白质设计循环 1 1蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面 在蛋白质设计开始之前 要对所要求的活性进行筛选 由于真菌与细胞相对容易处理 因此它们是一个生物活性物质源 由于基因工程的发展 真核基因表达技术的发展使动物蛋白质与植物蛋白质的数目迅速增长 又增加了新的生物活性物质源 筛选以及纯化蛋白质需要进行细致的表征 测定它们的序列 三维结构 稳定性 催化活性等 专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键 一些新技术 如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速 容易 计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置 建立蛋白质三维结构模型 确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的 在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后 可以进行定位突变 但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的 可能需要经过几轮的循环 1 2蛋白质三维结构知识的必要性 蛋白质三维结构知识对于蛋白质工程是绝对必要的 目前PDB ProteinDataBank 已收集数以万计个蛋白质晶体结构 但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍 当我们开始对某一天然蛋白质进行蛋白质分子设计时 首先要查找PDB了解这个蛋白质的三维结构是否已被收录 如果PDB中没有收录又未见文献报道 我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构 或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型 功能数据库 1 KEGG京都基因和基因组百科全书 KEGG 是系统分析基因功能 联系基因组信息和功能信息的知识库 http www genome ad jp kegg 2 DIP相互作用的蛋白质数据库 DIP 收集了由实验验证的蛋白质 蛋白质相互作用 http dip doe mbi ucla edu 3 ASDB可变剪接数据库 ASDB 包括蛋白质库和核酸库两部分 ASDB的网址是 http cbcg nersc gov asdb 4 TRRD转录调控区数据库 TRRD 是在不断积累的真核生物基因调控区结构 功能特性信息基础上构建的 http wwwmgs bionet nsc ru mgs dbases trrd4 5 TRANSFACTRANSFAC数据库是关于转录因子 它们在基因组上的结合位点和与DNA结合的profiles的数据库 http transfac gbf de TRANSFAC 1 3设计目标及解决办法 蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程及蛋白质分子设计都是至关重要的 如果我们想改变蛋白质的性质 必须改变蛋白质的序列 Hartley等于1986年完成了一个我们所要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表 该表至今仍有参考价值 蛋白质设计的目标及解决办法 Tyr酪 Phe苯丙 Cys半胱氨酸 ser丝 thr苏 ala丙 val缬 leu亮 ile异亮 met蛋 gly甘 asn天冬酰胺 gln谷酰胺 asp天冬氨酸 glu谷氨酸 tyr酪 trp色 his组 蛋白质突变体的设计涉及如下3个步骤 1 从天然蛋白质的三维结构出发 实验测定或预测 利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸 这是非常关键的步骤 一般应注意如下问题 a 应确定对蛋白质折叠敏感的区域 这些区域包括带有特殊扭角的氨基酸 盐桥 密堆积区等 b 应确定对功能非常重要的位置 这些可以从结构与功能关系 生物化学或蛋白质工程实验及结构上的考虑 c 应该考察剩余位置对所希望改变的影响 d 当进行互换或插入删除残基时应考虑它们对结构特征的影响 如疏水堆积 侧链取向 氢键 盐桥等 同时也要考虑它们对蛋白质功能的影响 互换或插入 删除区域一般都在外环 有如下一些假设 氨基酸侧链的改变不会影响该主链折叠的改变 插入 删除某些部分不会影响表面区域 侧链交换遵守蛋白质结构保守原则 2 利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构 3 预测的结构与原始的蛋白质结构比较 利用蛋白质结构 功能或结构 稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质 在上述设计工作完成后 要进行合成或突变实验并经分离 纯化及表征后得到所要求的新的蛋白质 计算机蛋白质设计只是有效实验设计的一种方法 它不能替代实验 正像蛋白质结构预测不能替代蛋白质结构测定一样 如果一个科学家设计一种具有新的催化性质的酶 他必须了解催化过程及机理 了解蛋白质的结构化学 生物化学方面的知识 因此蛋白质设计的成功与否 必须要有理论与实验的紧密结合 2 1内核假设在蛋白质内部侧链相互作用决定蛋白质特殊折叠 一个非常简单 有用的关于蛋白质折叠的假设是 假定蛋白质独特的折叠形式主要由蛋白质内核中残基的相互作用所决定 所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域 在大多数情况 内核由氢键连接的二级结构单元组成 二 蛋白质设计原理 2 2所有蛋白质内部都是密堆积 很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体 并且没有重叠 这个限制是由两个因素造成的 第一个因素是分子是从内部排出的 这是总疏水效应的一部分 第二个因素是由原子间的伦敦色散力所引起的 是由于短吸引力的优化 2 3所有内部的氢键都是最大满足的 主链反侧链 蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应 溶剂键被蛋白质键所替代 随着溶剂键的断裂所带来的能量损失是由折叠状态的重组以及可能释放一个结合的水分子而引起的熵的增益所弥补 2 4疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面 这种分布代表了疏水效应的主要驱动力 这种分布的正确设计不是简单地使暴露残基亲水 使埋藏残基疏水 至少有两种原因使图像复杂化 首先 侧链不总是完全地亲水 例如赖氨酸有一个带电的胺基 但是连接到主链上的碳原子是疏水的 因此在建模过程中要在原子水平上区分侧链为疏水及亲水部分 第二 正确的分布是更安排少许疏水基团在表面 少许亲水基团在内部 2 5在金属蛋白中 配位残基的替换要满足金属配位几何 这要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子 并符合正确的键长 键角以及整体的几何 2 6对于金属蛋白 围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的 大部分配基合有多于一个与金属作用或形成氢键的基团 如果一个功能基团与金属结合 另几个功能基团可以自由地采取其他的相互作用方式 总结金属蛋白的结构表明 这些第二基团总是参与围绕金属中心的氢键网络 氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用 有时也参与同侧链或水分子的相互作用 这些相互作用起到两个作用 第一符合蛋白质折叠的热力学要求 第二这些氢键固定在空间的配位位置 2 7最优的氨基酸侧链几何排列蛋白质中侧链构象是由空间两个立体因素所决定 首先侧链构象是由旋转每条链的立体势垒所决定 其择优构象可以通过实验统计测量 也可以由第一原理计算得到 第二个因素是由氨基酸在结构小的位置所决定 蛋白质内部的密堆积表明在折叠状态侧链构象只能采取一种合适的构象 即一种能量最低的构象 2 8结构及功能的专一性 形成独特的结构 独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志 实践表明这是蛋白质设计最困难的问题 要构筑一个蛋白质模型必须满足所有的合适的几何要求 同时满足蛋白质折叠的几何限制 因为蛋白质是一个复杂的体系 体系有可能采取一个能量与所希望状态相近的另外一个构象 因此在设计程序中必须引入一个特征 它稳定所希望的状态 而不稳定不希望的状态 这也是最困难的计算机模拟技术之一 目前蛋白质设计还是实验性科学 它的成功需要几个 设计循环 即设计 构筑 再设计等 情况愈复杂 循环次数就会众多 虽然困难 但是仍然是有成果的 它可以在实践中发现新的因素 产生新的概念并修正老的概念 三 蛋白质设计中的结构 功能关系研究 3 1蛋白质结构 功能关系的重要性蛋白质的序列 三维结构 热力学及功能性质之间的关系是目前广泛关注的热点 它对于蛋白质工程及蛋白质设计都是非常重要的 这方面的研究有助于基于序列和三维结构信息预测蛋白质的功能以及序列的改变如何影响蛋白质的功能 这将增加设计具有预定结构与功能的蛋白质的能力 对蛋白质结构与功能的认识过程始于蛋白质中重要功能残基及蛋白质与其他分子相互作用的确定 3 2定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用通过定位突变替换单独的氨基酸残基是分析功能残基的有力工具 选择突变残基 最重要的信息来自结构特征 因此如果蛋白质的立体结构是未知的 则突变功能残基的研究带有不确定性 不能很好区别蛋白质构象扭曲变化的影响与原有功能残基突变的影响 可以根据序列同源性或原先的生物化学实验证据选择突变残基 也可以通过随机或合理筛选技术签定重要的功能区域 以便进一步重点分析蛋白质功能残基 定位突变可以在蛋白质中引入特殊的替代氨基酸并显示蛋白质功能的损失及变化 因此它是鉴定蛋白质功能残基的重要手段 对于蛋白质中某些已经通过结构及生物化学实验证明其功能重要性的残基 通过 定位突变可以探测它们的作用机理 这些研究为认识蛋白质 蛋白质相互作用及酶催化的本质提供理论基础 也为蛋白质工程及蛋白质设计提供依据 蛋白质结构与功能关系研究也可用于药物开发 3 3定位突变种类 插入一个或多个氨基酸残基 删除一个或多个氨基酸残基 替换或取代一个或多个氨基酸残基 最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法 突变的加和性原则 3 4突变蛋白质结构的评估 溶解性热力学分析 射线晶体学及 谱园二色散方法单克隆抗体探测构象变化 热力学分析可以用于测量突变蛋白质的热稳定性及化学变化自由能 并可作为构象整体性的检测 X射线晶体学及NMR谱可以直接提供突变蛋白的高分辨率结构及评估结构整体性 但是这些方法需要较大量的纯的突变蛋白并要花较长时间 因此这些技术不能用于常规的大量突变体的分析 圆二色散方法是可用于分析突变体结构的另一生物物理方法 虽然这个方法可以快速分析 但也同样需要较大量的纯突变蛋白 它的另一缺点是只提供二级结构及三级结构的相对变化 3 5蛋白质中功能残基的鉴定 3 5 1根据已知结构信息确定功能残基对于三维结构已经经过x射线测定或NMR谱测定的蛋白质 可以根据氨基酸来推测专一性残基的功能作用 如果蛋白质与它们的抑制剂 辅酶及受体的三维结构是已知的话 这个方法就更有价值 可以根据蛋白质上的氨基酸与配件上的受体基团间的距离与取向决定它们之间形成的氢键 离子对或疏水相互作用 这样的残基通过定位突变取代后 能够证实某一残基对键合过程的参与以及每一个相互作用对复合物结构的贡献 这样的研究是认识专一性及酶催化的基础 3 5 2突变实验方法鉴定功能残基随机突变 删除分析以及连接段扫描突变等实验方法可用于鉴定功能残基 随机突变技术分析蛋白质功能的优点是用一种简单方法就可产生突变体 然而 因为对于突变没有控制 因此必须进行大数目的突变产生大量的可解释的数据 往往非保守残基或小的氨基酸残基会被大的氨基酸所替代 这两种突变都会引起蛋白质构象的变化及引起功能的损失 在这些研究中 在每一个位置上的氨基酸由不同的几个氨基酸所替换 可以比较蛋白质保守及非保守替换对功能的影响 3 5 3利用蛋白质同源性鉴定功能残基随着克隆基因数据库的增加 根据与其他蛋白质的序列对准确定蛋白质中的功能域已成为可能 每个残基所起作用的信息能够来自不同种同源蛋白的序列比较或一类具有相应活性的蛋白质的序列比较 同源蛋白质的保守的残基是保持那类蛋白质共同的功能或者是维持共同结构的关键因素 相反 在一类蛋白质内变化的残基看来对结构及功能是不重要的 但涉及在分子识别中起作用的专一性 这两个假设已经用于指导位点突变分析蛋白质 四 天然蛋白质的剪裁 分子剪裁是指在对天然蛋白质的改造中替换1个肽段或一个结构域 winter等将分子剪裁技术成功用于抗体分子的改造 他们将小鼠单克隆抗体分子重链的互补决定子用基因操作方法插到人的抗体分子的相应部位上 使得小鼠单抗分子所具有的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上 这项实验有重要的医学价值 3 6结构与功能的容忍度 蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度 即结构与功能关系有一定的稳健度 Fersht等替换了Barnase的所有内核残基 结果表明23 的突变体保留了酶的活性 Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基 实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠 这些结果说明不同的氨基序列具有相近的设计的结构 第二节全新蛋白质设计 一 引言1 1特征全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程 合成具有特异结构与功能的新蛋白质 根据所希望的结构及功能设计蛋白质或多肽的氨基酸序列 全新蛋白质设计是根据所希望的结构及功能设计序列 称反折叠研究 蛋白质的功能是直接与它的三维结构相关的 通过序列的改变来操纵结构提供功能的多样性 基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化蛋白质的活性 改善它们的药效动力学性质 而全新蛋白设计是另一类蛋白质工程 它合成具有新奇的结构与功能的新蛋白质 1 2蛋白质的全新设计内容 蛋白质结构的从头设计蛋白质功能的从头设计取得的进展 血红素结合蛋白 氧化还原活性蛋白质 DNA结合蛋白及基于蛋白质的高分子材料 二 蛋白质结构的从头设计 二级结构模块单元的自组装 配体诱导组装 通过共价交叉连接实现肽的自组装 在合成模板上肽的组装 线性多肽折叠为球状结构 基于组合库的全新蛋白质设计 设计一个新奇的蛋白质结构的中心问题是设计一个具有稳定及独特的三维结构的序列 要达到这个目标需要克服的基本障碍是线性聚合链的构象熵 例如 如果在具有100个残基的蛋白质中每个残基采取10个可能构象中的一个构象 则这条链折叠成为确定的三维构象所消耗的熵568 48kJ mol 这个数字代表不合适的自由能的真实的量 因此要实现正确的折叠必须借助于许多合适的相互作用 要使一个序列能折叠为确定的三维结构 设计的相互作用能必须超过构象熵 可以采用不同的策略达到这个目标 最主要是使相互作用的强度与数目达到最大 另一个策略是通过共价交叉连接减小折叠的构象熵 根据第一原理设计一个蛋白质 我们必须依赖于分析已知结构的天然蛋白质中的二级结构单元 例如螺旋 折叠片 环 以及转折 得到一些结构知识 这些知识涉及氨基酸形成二级结构的倾向性等 十多年来 科学家对螺旋已有很好的认识 近几年的重点在于二级结构在三维空间形成的独特的构象通过长程相互作用可控形成超二级结构 我们可以有把握地设计并合成螺旋束 折叠片以及 模块 它们的形成规律比较清楚 成功的概率也比较高 蛋白质中不同层次的结构组织见图2 6 分析己知结构的蛋白质 可以认为复杂的三级折叠和四级结合可以分解为有数的二级结构单元 例如螺旋 串 转角 它们通过LOOP连接为三级结构 特殊折叠的稳定性是由一定距离残基间键相互作用决定的 全新蛋白质设计要求很好地认识蛋白质结构及稳定性的规律 在了解残基形成二级结构单元的倾向性后 要安排残基的最大的疏水相互作用形成一个紧密的疏水内核 离子相互作用及氢键可以进一步用于稳定蛋白质的结构 另外一种途径是根据主链的构象限制设计二级结构 1 二级结构模块单元的自组装设计新的蛋白质结构的最简单 最直接的策略是合成单一二级结构单元 螺旋或折叠股 作为多肽链的片段的模块途径 然后复制这些二级结构片段并把它们连接为整个蛋白质结构 通常 这些二级结构是两亲性的 疏水表面埋藏在内核形成紧密的蛋白质结构中 如图2 7所示 2 配体诱导组装全新蛋白质设计的第二个策略是使用一个配体 典型的是一个金属离子 诱导模块蛋白片段的组装 如图2 10所示 一个配位结合位点设计在结构中几个相互作用片段的界面处 如果这个位点对配体有很高的亲和力 则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并驱动肽自组装 3 通过共价交叉连接实现肽的自组装设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵 当几个没有连接的肽链进行自组装时 熵势垒是比较难以克服的 通过共价交叉连接可以减少构象熵 因此共价连接他们的预组织肽是直接形成所希望结构的有力途径 如图2 13所示 4 在合成模板上肽的组装Mutter及其合作者发展了一种模板组装合成蛋白 TASPs 方法 他们不是使用天然蛋白中的turn和loops连接二级结构单元 而是使用图2 16中所显示的人工模板 同天然线性蛋白质不同 螺旋和折叠股在一个特殊折叠过程有一个正确的相对取向 TASP分子的螺旋和股通过模板结构导向形成所希望的构象 5 线性多肽折叠为球状结构不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠形成球形的确定的三维结构是全新蛋白质设计追求的目标之一 把一个线性肽折叠形成独特的三维结构的主要障碍是构象熵 这需要精心设计一系列的相互作用才能稳定结构 这方而工作已取得重大进展 6 基于组合库的全新蛋白质设计蛋白质组学是目前备受关注的新领域 它包括天然蛋白质的多样性 相互作用 结构以及功能 它回答的问题是 什么是天然存在的 组合库方法要回答的问题是 什么是可能的 要问答这个问题是要构筑大的全新蛋白质库 比较库中的全新蛋白质与自然进化选择的蛋白质 可以得到很多有用的信息 所有可能的氨基酸序列是一个天文数字 例如一个含有100个残基的序列可能有20100种 但是实际能形成独特三维结构的序列仅占序列空间的很小部分 组合库的构筑既要顾及序列的多样性又要利用合理设计大大减少序列的数目 组合库设计的一个核心问题是埋藏疏水部分 一个常用的方法是基于极性 P 和非极性 N 氨基酸的 二元模式 二元模式 一方面要有利于形成二级结构 另一方面又要埋藏疏水残基 二元模式可用于二级结构两亲片段 一面完全是极性残基 另一面完全是非极性残基 组合库的设计中要考虑优化疏水核 通过筛选发现最优的堆积相互作用 主要使用两种筛选方法 第一种是使用一维1H NMR谱 第二种方法是使用电喷雾质谱 ES MS 观察H D交换动力学 除了考虑疏水核堆积外还要考虑优化二级结构单元间的界面 近年来发展了一些计算机辅助设计方法 在开始实验之前先进行计算机筛选 一般分为两步 第一步建立侧链的旋转构象库 rotemer 第二次把Rotomer库作为输入 计算低能序列组合的可能性 三 蛋白质功能的全新设计 蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能 功能设计主要涉及键合及催化 为达到这些目的可以采用两条不同的途径 反向实现蛋白质与工程底物的契合 改变功能 从头设计功能蛋白质 蛋白质的功能设计 通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能 键合及催化的从头设计 在全新蛋白质中引入结合位点 催化活性蛋白质的设计 膜蛋白及离子通道的设计 新材料的设计 1 通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能执行特别生物功能的天然蛋白质能通过反向拟合获得新的活性 修饰进化亿万年的蛋白质 执行我们自己选择的功能是非常诱人的任务 自然界已经向我们提供许多相对稳定 能够耐受序列修饰改变的结构骨架 通过修饰天然结构得到专一性及活性改变的天然蛋白质是可能的 在如下范围已取得成功 DNA结合专一性 改变辅因子的专一性 改变底物的专一性 反向拟合的能力大于仅仅改变专一性的修饰 事实上 它能把新奇的性质附加到原蛋白质骨架的结构上 如下几个是通过蛋白质工程使天然蛋白质获得新功能的实例 1 引入金属结合位点在E Coli大肠杆菌中引入新的过渡金属结合位点以及在溶菌酶中引入新的钙结合位点 用天门冬氨酸侧链替代Gln86以及Ala92引入钙结合位点 使金属 溶菌酶的活性及热稳定性都优于天然酶 2 位点专一DNA裂解重组脱氧核犊核酸酶蛋白质的一个52残基的DNA 结合碎片共价连接一个鳌合试剂EDTA后形成一个序列专一的DNA裂解蛋白质 催化抗体的设计是反向拟合天然蛋白质最广泛 最有力的应用 抗体是嫁接功能的理想蛋白 通过改变loop区免疫体系能产生新奇的结合专一性 免疫学家以及化学家诱导哺乳动物免疫体系产生不仅能结合专一抗原而且能催化不同化学反应的抗体 催化抗体的核心是使用类似于反应过渡态的抗原 2 键合及催化的从头设计能结合特殊配件的新蛋白质设计的早期工作是Gutte及其合作者开展的 1979年他们报道了能与核酸相互作用的34个残基肽的设计 合成与表征 3 在全新蛋白质中引入结合位点全新蛋白质设计除了能折叠为预想的结构外 还要设计新的结合位点及催化性质 全新蛋白结合位点的设计不仅限于金属位点 4 催化活性蛋白质的设计这类设计的早期代表性工作是Hahn设计的Chymhelizyme及Sasaki等设计的Helichrome 后来人们企图根据第一原理设计活性位点而不是模拟已知酶 5 膜蛋白及离子通道的设计膜蛋白在许多生物过程中起重要作用 设计与构筑具有预期结构与性能的膜蛋白有非常重要的意义 膜蛋白结构形成的驱动力与在水中可溶的蛋白是不同的 设计及合成中所遇到的因难也是不同的 例如疏水效应要求在溶液环境中非极性残基在内部 极性残基在外部 但对于在非极性环境中的膜蛋白就完全不同 膜蛋白在体内表达或在体外合成形成典型的包含物 一个全新膜蛋白从一个不溶水的聚集体转换为类似于膜的环境要求构象变化 尽管存在很大困难 但科学家们仍设计表征了一些全新膜蛋白 6 新材料的设计自组装是构筑新材料的重要