微生物标本送检的重要性与临床应用

微生物标本送检的重要性与临床应用 九 0三医院检验科 李佳 参考标准及指南 参考标准及指南 一、微生物标本采集送检的要点 二、解读微生物检验结果 三、答疑解惑 四、 2014年四川地区细菌分布及耐药性分析 感染性疾病 感染的病原体： 细菌 ，病毒， 真菌 ， 寄生虫 ，非典型病原体（支原体、衣原体、 军团菌、 非结核分枝杆菌 、螺旋体 ）等 感染的部位： 各脏器（肝胆胰脾肾心肺胃肠道生殖泌尿道以及中枢神经系统等） 、皮肤软组织. 医院常见的感染性疾病 呼吸道感染： 上呼吸道感染 下呼吸道感染：气管（支气管）炎 社区获得性肺炎 CAP 院内获得性肺炎 HAP 泌尿系感染：上、下 血流感染（败血症） 腹部感染：腹膜、肝胆胰脾肾、盆腔 中枢神经系统感染 其他：心内膜炎、骨髓炎、关节化脓性病变 . TB- MDR 病原体的多样化和复杂化 H7N9 SARS 超级 细菌 我们应该追求： “ 准确的病原学诊断 ” “ 针对性病原学治疗 ” 正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提！ 微生物让人类步步为营， 痰培养标本 采集与运送 咳痰标本的采集 标本采集方法 医师或护士直视下采集标本 病人先漱口，去除表面的菌群 教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 病原体种类繁多而复杂 使下呼吸道感染病原诊断成为难题 细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌） 真菌（包括肺孢子菌） 病毒 支原体、衣原体与立克次体 原虫 寄生虫 咳痰途经口咽部 唾液中口咽部定植菌的浓度可达108-109/ml。 研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。 不可避免地受到污染 下呼吸道感染病原学诊断注意事项 痰标本的正确采集（包括导痰） 痰标本及时运送和处理的重要性 痰标本的洗涤与匀化 痰涂片：质量评估和细菌、真菌初步报告 接种平板：质量与质控，血、巧克力、麦康凯、沙保弱 培养环境： CO2 培养时间： 24h， 48h 菌落观察要点 结果报告：所有菌种（群），包括半定量 临床意义判定 其他病原体的检测：结核、真菌、厌氧菌、非典型病原体 关于咳痰标本 在抗生素应用前采集痰标本 ; 标本采集后 1 2h内必须立即进行实验室处理； 咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本 ; 取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口 ; 深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导 ; 无痰可用 3 5 NaCl 5ml雾吸约 5min导痰； 也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰； 痰培养的送检次数 对于普通细菌性肺炎， 痰标本送检每天 1次，连续 2 3天。 不建议 24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变； 怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集 3天清晨痰液送检； 痰培养的拒收 光学显微镜细胞学检查发现口咽分泌物污染明显。 没有标签或贴错标签。 运送容器选择不当或有渗漏。 标本采集不符合要求。 同一天同一试验重复送检 2次。 延时送至实验室的标本。 血培养标本 采集与运送 血培养的采集时间 对怀疑菌血症、真菌血症的患者，在考虑使用抗菌药物之前，采集血培养标本。 发热前半小时，寒战高热期 必须同时或间隔短时间内采集套以上血培养标本。 血培养的采集次数 患者：推荐同时采集套（不同部位）血培养标本。（即双瓶双臂同时采集血培养标本。） 婴幼儿患者：推荐同时采集次（不同部位）血培养标本。 血培养的采血量 成年患者：推荐采血量为每套不少于10ml，每瓶不少于 5ml。 婴幼儿患者：推荐采血量每瓶不少于2ml。（少于病人总血容量的 1%） 血液标本在需氧瓶和厌氧瓶中的分配 常规血培养组合：一个需氧瓶和一个厌氧瓶作为一套血培养。 当被用来做培养的采血量少于推荐值时，血必须首先接种需氧瓶，然后将剩余的血液接种入厌氧瓶。 皮肤消毒 推荐使用碘町、洗必泰或碘伏作为皮肤消毒剂。 碘町作用 1min 碘伏作用 1.5-2min 洗必泰作用时间与碘町一样（但不能用于少于 2个月婴儿皮肤消毒） 采集部位 推荐从外周静脉采集血液标本。 不推荐动脉血，因其诊断价值没有比静脉血更大。 不推荐静脉留置导管，因其常伴有高污染率。如果必须从留置导管内采血，也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本以帮助阳性结果的判读提供解释。 采集方法 在采血之前，血培养瓶的橡皮塞需使用 70%酒精消毒并干燥。然后再进行穿刺部位的皮肤消毒。 严格按照 “酒精、含碘消毒剂、酒精 ” 的消毒步骤操作，并等待足够的消毒时间。 严格无菌操作，不允许在皮肤消毒后用手接触静脉，除非带有无菌手套。 不推荐采血和接种血培养瓶更换注射器针头。 血培养标本的运送 采集后的血培养瓶应在 1小时之内送往实验室。 血培养瓶在采血接种后在室温不超过数小时。 血培养瓶在接种前和接种后均不得冷藏或冷冻。 血培养标本的拒收 瓶子上帖的标签错误或未帖标签。 血培养瓶打破的、损坏的或渗漏。 血液凝固。 尿培养标本 采集与运送 你知道吗？ 尿液通常是无菌的或一过性有少量微生物，但是尿道内或尿道周围皮肤的菌群会污染尿液标本，从而可能导致错误的培养结果。 诊断症状明显的病人（如尿急、尿频、尿痛），一份标本就已足够，治疗 48-72小时后再采集第二份标本。对于症状不明显的病人，需采集 2-3份标本。怀疑肾结核时，应连续 3天采集晨尿。 多次收集或 24小时尿不能用作培养。 申请单上必须注明病人症状是否明显，这对于定量培养分析非常重要，尤其只有少量尿液标本。 室温都有利于病原菌和污染菌会生长繁殖，因此若 30min内不能及时培养尿液则必须冷藏，但也不能超过 24小时。 尿培养标本 清洁中段尿 导尿导管尿 经耻骨上皮肤穿刺采集膀胱内尿液 送检标本以晨起第一次尿液为佳 不能立即送检者，可暂存 4 冰箱，但保存不超过 8h 清洁中段尿液 尽量取早晨第一次尿液 弃去开始流出的尿液，以冲刷尿道口的细菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿 详细告知病人以下操作步骤 女性病人 收集标本前用清洗液冲洗干净，从前向后仔细擦洗尿道区域 分开阴唇，开始排尿 排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 回缩包皮并清洗龟头 排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 导尿管尿液 集尿袋内的尿液不能用作培养； 导尿管末端的尿液也不能用于培养，因为很难避免没有尿道菌群污染。 留置导管尿液标本常通过专门的采样端口采集，不能把导尿管与尿袋拔开后收集尿液。 采样端口用酒精消毒；必要时，可先夹住导尿管但不能超过 30分钟；将注射器针头插入采样端口，抽吸出尿液；注入无菌杯或试管中 耻骨上穿刺吸取尿液 常用于患儿、泌尿道厌氧菌感染或脊柱损伤病人等。 可避免尿道或会阴细菌的污染，但对膀胱内少量尿液的小儿难以实施。 方法：消毒自脐以下至尿道之间区域的皮肤，局麻穿刺点部位；在耻骨联合与脐连线上，高于耻骨联合 2cm处进针刺入膀胱；取 20ml尿液；置于无菌容器中并送往实验室。 可用于厌氧菌检测 粪便培养标本 采集与运送 粪便标本的采集方法 自然排便采集标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部份的粪便 1 3g。 液体粪便则取絮状物，一般取 1 3ml，直接装入粪便容器或运送培养基中送检。 直肠拭子采集粪便标本：先以肥皂、水和 70%酒精，将肛门周围洗净，然后用经无菌盐水湿润的棉拭子插入肛门超越肛门括约肌约 2-4cm，与直肠粘膜表面接触，轻轻旋转，必须将棉拭子置于运送培养基中送检。 粪便标本的运送 一般粪便标本装于无菌封闭广口塑料杯；直肠拭子置于 Cary Bair拭子转运系统。做霍乱弧菌检查的粪便标本置于碱性蛋白胨水试管中。 粪便标本：室温 1小时内送至。 直肠拭子：室温 1小时内送至。 高度怀疑霍乱弧菌感染的标本室温 1小时内送至，运送必须符合特殊标本的安全要求。 你知道吗？ 住院超过 3d或入院诊断不是胃肠炎的患者不做常规粪便培养。 除婴儿和有活动性腹泻症状的患者外不推荐用拭子做常规病原检测。 有腹部痉挛的患者在发病 6h内采集到的血便或液状便的效果最好。 对于弧菌的培养需要提出特别申请。 脑脊液标本 采集与运送 脑脊液标本的采集方法 以 70%酒精或 2%碘酊消毒背部下方，并麻醉之； 然后以一特制通管针，轻轻的由第三与第四腰椎间的中线部位穿刺入脊髓蛛网膜，采集约 3-5ml脑脊液于 3支无菌试管中，每支试管至少1-2ml； 然后马上将第 2支（或第 1支）送至实验室。 做脑脊液培养时，建议同时做血培养。腰穿时必须作彻底消毒和无菌操作。 脑脊液标本的运送 常温立即送检，实验室收到标本后应立即接种。 脑脊液标本送检的理想时间为 15分钟内，半小时送检是可接受的，如果送检时间超过 1小时，则会影响结果，在结果报告时，在备注处注明此情况。 如不能及时送检，可使用血培养瓶（怀疑脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌感染时，请勿使用血培养瓶） 穿刺液标本 采集与运送 穿刺液标本的采集方法 由临床医生进行。 胆汁的采集方法有三种：十二指肠引流法（以“ B”管 来自胆囊，做细菌培养意义较大）、胆囊穿刺法及手术采取法，由临床医生采取，约 2ml左右放入无菌密封容器立即送检。 其它穿刺液的采集方法： 2%碘酊消毒要穿刺的皮肤后，由临床医生穿刺采集标本（ 2ml左右），装入无菌密封容器立即送检。 穿刺液标本的送运 采集后应正确盖好，防止泄漏或容器外部留有残留物。 保温立即送检，保证在 15min内送至实验室，实验室收到标本后应立即接种。 为提高阳性率，像胸腹水等标本，可接种到血培养瓶中送检。 手术切口与软组织感染标本 采集与运送 皮肤组织标本 标本的选择更大程度上依赖于感染的程度和性质而不是可疑的病原体。 对大多数开放伤口，采集前应先去除表面菌群。 除非有渗出物，干燥、结痂伤口一般不做培养。 闭合脓肿应取渗出物和脓肿壁标本。 开放脓肿处理同开放伤口。 烧伤伤口应在广泛清洗和清创术后采集培养。建议取活检标本，伤口表面定量培养不一定有意义。 代表性的标本应采自病灶活动区域或基底部有而不仅仅是脓液。 采集方法 未破裂脓肿：不能用拭子。消毒覆于脓肿表面的皮肤，用注射器将脓肿内容物吸出。然后切开脓肿、引流，取部分脓肿壁送检。送检时，标本都置于厌氧培养基中。 开放病灶和脓肿：尽量去除表面菌群，用拭子采集病灶及底部或边缘的标本，置于需氧培养基中。也可对渗出液作厌氧培养。开放病灶不能做厌氧培养。 烧伤伤口：清创，出现渗出液后以拭子用力采集，仅作需氧培养。也可送检活检组织标本。 脓疱或水疱：酒精消毒使之干燥，对于患儿用 23号针头挑破脓疱，拭子采集脓疱液和基底部标本。 标记：不要只写 “ 伤口 ” 标记标本，应有专门的描述和解剖来源。注明渗出液来自开放伤口还是闭合伤口。 注意事项 迅速送往实验室， 1小时内不能培养应将标本冷藏。 皮肤消毒对培养结果至关重要。 革兰染色对标本进行评估。涂片中如出现上皮细胞提示标本已被污染。没有上皮细胞而有白细胞说明标本采集正确。 不要仅送检脓液。脓液不能代表伤口特点，应在病灶活动区域或基底部采集标本。 小儿要求：小儿感染常出现皮疹如水泡等，应在这些地方仔细采集标本培养以发现病原体。创伤标本如没有炎性细胞可能说明采集了表皮正常菌群，与疾病过程无关，应重新采集。 一、合格的微生物标本是准确的病原学诊断的前提 二、解读微生物检验结果 二、临床常见的问题的答疑解惑 三、 2014年四川地区细菌分布及耐药性分析 细菌涂片报告 鉴定及药敏报告 细菌涂片结果的解读 痰标本 粪便标本 无菌体液标本（尿液，穿刺液，脑脊液，脓液等） 痰液标本涂片报告解读 痰标本细菌涂片： 病人信息，标本质量评估，细菌种类，排列，细菌数量，特殊形态 痰标本细菌涂片 合格： WBC25/LP 鳞状上皮细胞 25/LP 鳞状上皮细胞 10-25/LP 非深部咳痰标本 WBC25/LP 痰标本质量评估 10鳞状上皮细胞 /LPF 拒收！ 弹性纤维，中性粒细胞多，鳞状上皮细胞少，有代表性的好标本。 评估标本是否格 WBC 25/LPF 鳞状上皮细胞 3种菌，考虑污染 未达到判定标准只报细菌 种类及数量 血培养：培养五日，无细菌生长 无菌标本：培养两日，无细菌生长 阳性报告 细菌种类 细菌计数 ：痰培养 尿培养 药敏分析结果： MIC 敏感度 耐药机制 痰标本半定量培养结果 分级 划线区菌落数 相当菌落数 cfu/ml 临床意义 一区 二区 三区 1+ 10 10 5 10 5 5 10E7 多位感染病原菌 尿标本半定量培养结果 病人 留取方式 有意义的菌落形成单位 /ml 无症状者 清洁中段尿 10e5 有症状，不固定 清洁中段尿 10e4 1-2种机会致病菌，若多余 2种则为污染 有症状，性活跃女性 清洁中段尿 100个纯菌落肠杆菌科细菌 男性 清洁中段尿 10e3个，机会致病菌 所有 内置导尿管 10e5任意数量机会致病菌 所有 直接导尿 100个任意数量机会致病菌 所有 手术取得 任意数量 所有 膀胱穿刺 任意数量 所有 任意标本 金黄色葡萄球菌 药敏实验报告 CLSI药敏折点 正确理解细菌的药敏报告意义 体外药敏试验的局限性 CLSI药敏 标准制定中的局限性 体外药敏试验不能反应病原菌和药物在体内的 动态变化 体外药敏判断标准未考虑药代学因素药物本身 的特性 (PK/PD) 不能完全反映体内的抗 菌效果 CLSI(NCCLs)的药敏标准 : 正常剂量 药物进入体内后 血液 中最高浓度 (Cmx)与该药物 体外最低抑菌浓度（ MIC）间的关系所制定。 一般情况下 Cmx高于待检菌 MIC4-8倍 :敏感（ S） Cmx/MIC=1-2倍 : Cmx/MIC1: 中介度 (I); 耐药 (R)。 CLSI还没有对 局部感染 的药敏判断标准。如果在上述高药 物浓度部位感染时，按 CLSI制定的标准判断敏感性就不能 获得体外药敏和体内疗效一 致的结果。 CLSI药敏标准制定中的局限性 WHY?! 我认真做了 的呀 ! 医技与临床的不和谐 感控、药学、微生物 临床一线 疑问一？ 微生物检验时效性太差，一般需要 3-5天出报告 对原始标本进行 革兰染色 快速鉴定及药敏 1 快速 鉴定药敏结果 全自动鉴定药敏仪器可以帮助实现 48小时报告结果 更快的为临床提供准确的抗生素结果 ! 1 day： 接种标本涂片并接种，按标本类型分类有序的放入各篮筐里孵育培养。 2 day： 一位人员 8:00am先把细菌较纯的标本上机，再上机其它的标本。 上机时间： 8:00am 报告时间： 上机当天 3:00pm后 陆续审核发送报告 1 day： 接受标本接种 无分类孵育。 2 day： 处理完所以标本后 k开始上机 鉴定药敏时间:10:30am 3 day： 报告时间： 审核发送报告 old new 工作流程 时间 (分钟 ) n = 5 株 菌 n = 24 株 菌 n = 96株 菌 涂布标本 1 5 16 添加基质 1 3 10 干燥 2 2 7 系统准备 5 12 43 出结果时间 总共 9 22 76 1.8 0.92 0.79 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight (MALDI-TOF) 基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪 VITEK MS更快地获取结果 快速报告结果产生临床效应 有效治疗 早期诊断 疑问二？ 有感染症状，细菌培养却是阴性 阴性检测结果临床意义 微生物标本阴性检测结果的原因 微生物室 检验手段和技能 医生 非感染性、已使用抗菌药物 采样部位、采样时机、标本质量 送检目的 （细菌？真菌？非典型病原体？） 护理或护工 保存、运送 采样部位 （血） “真阴性 ” 的几种可能 呼吸道标本 常规方法（ SP、 BLAF）仍可能 50%阴性， 漏检的可能病