无菌检验课件PPT课件.ppt

医疗器械无菌检验 何燕英heyy2006 广东省医疗器械质量监督检验所2011年07月 1 概述 直接进入人体血液循环系统 肌肉 皮下组织或接触创伤 溃疡等部位而发生作用的制品或要求无菌的材料 灭菌器具等都要进行无菌检查 无菌 是指微生物存活概率低于10 6 无菌医疗器械 表示为医疗器械中 有残存微生物的医疗器械的概率小于10 6 即一百万件中小于1件 2 无菌检验 用于检验一次性使用无菌医疗器械是否染有活菌的一种方法 本实验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内 以检验供试品是否有细菌和真菌污染 其全过程必须严格遵守无菌操作 防止微生物污染 同时也应避免在抑菌条件下进行实验操作 3 检测标准 GB T14233 2 2005 医用输液 输血 注射器具检验方法第二部分 生物试验方法 中 3 无菌实验 中华人民共和国药典 2010年版二部附录XIH 无菌检查法 4 实验条件 无菌操作技术实验环境实验器材 5 无菌操作技术 微生物学基础微生物实践基础无菌操作意识 6 实验环境 洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域或隔离系统定期按GB T16292 16294 2010 医药工业洁净室 区 悬浮粒子 浮游菌和沉降菌的测试方法 的现行国家标准进行洁净度验证实验中监控 实验时将制备好的营养琼脂平板打开放于实验台上 至实验结束收起 30 35 培养48h 菌落平均数应小1cfu 90mm 7 实验器具 仪器超净工作台 光学显微镜 恒温培养箱 压力蒸汽灭菌器 集菌仪 比浊仪等 用具试管 注射器 三角瓶 刻度吸管 移液器 精密pH试纸 集菌培养器 剪刀 镊子 无菌服 牛皮纸等 8 实验准备 实验环境保证实验试液培养基灭菌方法 9 实验环境保证 环境清洁 表面消毒 75 V V 乙醇 新洁尔灭 1 1000 溶液或其他适宜消毒溶液 空气过滤系统 紫外灯或臭氧空气消毒仪 10 实验试液 稀释剂1 0 9 氯化钠溶液2 0 1 蛋白胨水溶液3 pH7 0氯化钠 蛋白胨缓冲液 调解pH至近中性 其中蛋白胨对菌细胞有保护作用 有利于菌数及控制菌测定表面活性剂与中和剂 11 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 用于培养好氧菌 厌氧菌 置30 35 培养其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层 粉红色 不超过培养基深度的1 2 在供试品接种前 培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1 5 否则 须经100 水浴加热至粉红色消失 不超过20分钟 迅速冷却 只限加热一次 并应防止被污染 12 培养基 改良马丁培养基 用于培养真菌 置23 28 培养欧 美 日药典 大豆酪蛋白水解液培养基 SCD 适用于需气 厌气真菌及需气菌培养 13 培养基 保存 2 25 避光保存时间非密闭容器中 一般在三周内使用密闭容器中 一般可在一年内使用 14 灭菌方式 湿热 115 121 15min 30min物品切勿立即取出置冷处 以免急速冷却 使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压 以致染菌 干热 160 170 2h适于耐高温的玻璃 陶瓷或金属器皿的灭菌 灭菌程序需要经过验证 15 培养基适用性检查 培养基的无菌性检查培养基灵敏度检查本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行 16 培养基的无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支 瓶 培养14天 应无菌生长 17 培养基灵敏度检查 菌种金黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 铜绿假单胞菌 CMCC B 10104 枯草芽孢杆菌 CMCC B 63501 生孢梭菌 CMCC B 64941 白色念珠菌 CMCC F 98001 黑曲霉 CMCC F 98003 18 培养基灵敏度检查 菌株要求传代次数不得超过5代 从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代 并采用适宜的菌种保藏技术 以保证试验菌株的生物学特性 19 培养基灵敏度检查 菌液制备细菌新鲜培养物 一般18h 24h 白念24h 48h 黑曲霉5 7天 用0 9 无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液 黑曲霉用含0 05 聚山梨酯80的0 9 无菌氯化钠溶液 20 培养基灵敏度检查 培养基接种金黄色葡萄球菌2支铜绿假单胞菌2支硫乙醇酸盐流体培养基枯草芽孢杆菌2支生孢梭菌2支空白对照1支每管小于100cfu 培养3天 21 培养基灵敏度检查 培养基接种白色念株菌2支改良马丁培养基黑曲霉2支空白对照1支每管小于100cfu 培养5天 22 培养基灵敏度检查 结果判断空白对照管应无菌生长 若加菌的培养基管试验菌生长良好 判该培养基的灵敏度检查符合规定 23 方法验证 无菌实验方法薄膜过滤法优先采用封闭式薄膜过滤器 也可使用一般薄膜过滤器 直接接种法 24 方法验证 薄膜过滤法规定量的供试品过滤接种硫乙醇酸盐流体培养基滤膜改良马丁培养基冲洗 每种菌均作1管不含供试品管作为对照加入试验菌过滤 25 方法验证 直接接种法硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌2管大肠埃希菌2管枯草芽孢杆菌2管生孢梭菌2管改良马丁培养基 白色念珠菌2管黑曲霉2管每种菌均作1管接入规定量的供试品 另1管作为对照品 26 方法验证 结果判断与对照管比较 如含供试品各容器中的试验菌均生长良好 则供试品的该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计 可照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查如含供试品的任一容器中试验菌生长微弱 缓慢或不生长 则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用 须依实际情况调整实验方法 并重新进行方法验证 27 供试品无菌检验 细菌检测管 硫乙醇酸盐流体培养基 供试品真菌检测管 改良马丁培养基 供试品阳性对照管 对应阳性菌 对应培养基 供试品阴性对照管 28 供试品无菌检验 检验数量 是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量 一般情况下 供试品无菌检查若采用薄膜过滤法 应增加最小检验数量的1 2作阳性对照用 若采用直接接种法 应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用 29 供试品无菌检验 检验量 是指一次试验所用的供试品总量 g或ml 采用直接接种法时 若每支 瓶 供试品的装量按规定足够接种两份培养基 则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基 采用薄膜过滤法时 检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量 只要供试品特性允许 应将所有容器内的全部内容物过滤 30 31 32 33 供试品无菌检验 供试品处理供试品进入无菌实验室前应作表面消毒 用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒 34 供试品无菌检验 供试品处理供试液制备水溶液供试品 取规定量 直接过滤或接种 必要时须冲洗或加入中和剂 灭活剂a 可溶于水的固体制剂供试品 按比例溶解稀释后同水溶液项检测b 内酰胺类抗生素供试品 按水溶液或固体制剂项检测 以 内酰胺酶清除或中和抗生素c 具有导管的医疗器具 输血 输液袋等 供试品 以一定量冲洗液冲洗内壁后 按水溶液项检测 35 供试品无菌检验 供试品处理供试液制备非水溶性制剂供试品 稀释液中加入聚山梨酯80或其他适宜乳化剂 混合后同水溶液项检测可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品 以十四烷酸异丙酯溶解过滤 仍无法过滤者用100ml稀释液萃取上述供试液 取水相作供试品检测无菌气 喷 雾剂供试品 20 冷冻1h 无菌钻孔 取样 依样品性质选择处理方法检测装有药物的注射器供试品 药液与针头均需检测 针头直接接种敷料供试品 100mg或1cm 3cm肠线 缝合线等供试品 直接接种灭菌医用器具供试品 直接接种放射性药品 直接接种 36 供试品无菌检验 培养及观察按规定的温度培养14天培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长 结果澄清无菌生长浑浊有菌生长转种同种新鲜培养基 观察是否长菌浑浊 无法判断或取培养液涂片 染色 镜检 37 供试品无菌检验 结果判断若供试品均澄清 或虽显浑浊但经确证无菌生长 判供试品符合规定 若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长 判供试品不符合规定 38 供试品无菌检验 结果判断符合下列任何一个条件 可判试验结果无效 1 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要