《进展汇报范例》PPT课件.ppt

米根霉整合表达载体构建及其遗传改造 报告人 张旻导师 姜绍通教授 背景及研究进展 米根霉Rhizopusoryzae是一种重要的工业微生物 是生产高纯度L 乳酸的理想菌种之一 同其他许多丝状真菌一样 由于其培养条件简单 具有高效的分泌表达系统以及易于实现大规模连续发酵等优点 也有着应用于同源或者异源蛋白表达 成为一种高效基因工程菌的潜力 加之米根霉全基因组测序工作已经完成并已在互联网中进行了公布 http www broadinstitute org annotation genome rhizopus oryzae MultiHome html 许多有待研究的未知功能的基因之序列及在基因组中所处位置也已为世人所知晓 对米根霉进行研究以及应用的空间又拓展到了一个新的层次 这也为米根霉基因改造工作提供了重要的前提条件 对于丝状真菌重组表达系统的研究工作主要是集中在子囊菌纲的曲霉菌属以及木霉菌属 以及少数几种毛霉目真菌当中 其中以粗糙脉孢霉及构巢曲霉最早建立其转化体系 分别为1983年和1979年 到目前为止已有近百种丝状真菌已经建立了DNA转化系统 但是对于米根霉基因功能及其异源蛋白表达系统的有关研究工作及资料仍然较少 相应的对于米根霉转化系统的建立的报道也是十分有限 且只适用于非常特殊的米根霉菌株 而非广泛适用 目前对于微生物菌株改造一般有两种策略 一 改造已有发酵能力的菌种 将其与底物利用相关的基因进行改造 增强其底物利用能力 二 选取不具备此种发酵能力 但是易于进行基因工程改造 或已经广泛应用为各种外源基因宿主 同时具备高蛋白表达量的菌株 常用的如大肠杆菌及各种酵母菌等等 导入关键酶基因 大多数丝状真菌以PEG CaCl2介导原生质体转化 电转化以及基因枪转化为主要的转化手段 营养缺陷标记与抗生素抗性标记作为筛选标记 目前脲嘧啶缺陷作为筛选标记应用比较广泛 相对的 对于宿主菌的要求也比较高 一般需自己诱变选育对应营养缺陷型菌株或者与菌株拥有者交流索取 以抗生素抗性 如新霉素 杀稻瘟素S 其他部分乙酰胺类抗生素 以及逐渐广泛应用于丝状真菌遗传转化的潮霉素等等的抗性 为选择标记在近年来发展较为迅速 随着多种抗生素抗性基因的分离及功能分析鉴定的完成 其作为一种方便并适用范围广的筛选方法被用于越来越多的丝状真菌转化研究当中 大多数丝状真菌采用整合型转化 通过单交换以同源或随机插入重组的方式整合到基因组中 尤其是对于米根霉 由于目前尚没有能在米根霉菌体内以稳定的形式自主复制的质粒 因此构建整合型质粒仍为第一选择 部分用于米根霉基因改造的载体构建及转化方法 部分学者的尝试与研究成果 目前所需要做的工作 针对米根霉设计一种能够适应于现有的野生型米根霉的基因转化及筛选体系 和对应的载体 应用这种体系对米根霉中特定的目标蛋白的编码基因进行改造 如木糖代谢相关酶 从而使米根霉的发酵性能得到强化 整体研究思路 OVER 木糖代谢限速步骤关键酶分析 以木糖为发酵底物比较XR与XDH活力 以木糖和木糖醇分别作为底物进行发酵 比较底物利用速率 菌体生长量以及乳酸产量 关键酶的编码基因序列 BACK 以木糖为发酵底物比较XR与XDH活力 BACK 注 酶活单位u定义为1分钟内转化NADPH NAD到NADP NADH的mmol数 以木糖和木糖醇分别作为底物进行发酵 比较底物利用速率 菌体生长量以及乳酸产量 以木糖 木糖醇为底物时底物残余量 以木糖 木糖醇为底物产酸情况 BACK 132h后菌体量 干重 关键酶的编码基因序列 从BroadInstituteofHarvardandMIT的米根霉基因组数据库RhizopusoryzaeDatabase http www broadinstitute org annotation genome rhizopus oryzae MultiHome html 中以Pichiastipitis Neurosporacrassa Aspergillusniger等的XR蛋白氨基酸序列及其对应编码基因序列为线索进行同源搜索 搜寻到米根霉基因组中含有的6条可能的米根霉XR编码基因序列 氨基酸序列同源率最低达到38 以上 将这6条序列在NCBI中再次进行比对分析 最终得到可能性最高的一条隶属于aldo ketoreductase家族蛋白的编码基因LocusRO3G 11716 3 而此基因编码的蛋白也与AspergillusclavatusNRRL1的D xylosereductase Xyl1 蛋白的氨基酸序列最为相近 都含有多个共同的保守序列 这些序列所在位置可能存在此种蛋白的一些潜在活性中心位点 同样 也获得了XDH及XK的可能的编码基因LocusRO3G 16589 3以及LocusRO3G 02257 3 这两条基因在NCBI不同微生物中相对应的酶类编码基因有着一定的同源性 BACK 目标DNA双链合成 BACK PCR所用引物及其序列 xk编码区片段PCR回收产物 1741bp xr编码区片段PCR回收产物 1123bp ldh编码区片段PCR回收产物 963bp ldhA xr等目标DNA扩增电泳及测序检测 BACK 扩增的片段经过回收后连入准备好的克隆 测序载体中转化感受态大肠杆菌进行克隆并用于测序分析 测序结果与米根霉基因组数据库RhizopusoryzaeDatabase中对应的transcript进行比对 NCBIAccession AB167714对应ldh LocusRO3G 11716 3对应xr LocusRO3G 16589 3对应xdh LocusRO3G 02257 3对应xk 对应的序列同源性为99 99 99 100 所扩增的片段序列与设计中所想要从基因组上截取的片段序列是吻合的 这样可为之后对着几条片段基因片段及其翻译表达的蛋白的进一步分析提供基础 这样的几条片段将被用于亚克隆到我们准备好的用于米根霉外源DNA转化的整合型表达载体内 在此之前 这些片段还要经过一些处理才能正常地受宿主米根霉调控而进行表达 目前真菌外源基因表达的常用启动子 异源基因在丝状真菌中的表达需要适当的真菌启动子 不同种属的丝状真菌启动子具有一定的交叉性 很多异源启动子可以在特定的丝状真菌中表达同源或异源的基因 一般规律 在丝状子囊菌及相应半知菌 无性阶段 内 真菌启动子有广泛的宿主范围 米根霉基因强启动子合成 PCR所用引物及其序列 BACK lpro ldhA上游257bp启动子区域片段 PCR产物电泳检测 pdcpro pdcA上游1083bp启动子区域片段 PCR产物电泳检测 amypro amyA上游899bp启动子区域片段 PCR产物电泳检测 pgkpro pgk2上游557bp启动子区域片段 PCR产物电泳检测 KmR 载体pEASY所携带的编码卡那霉素抗性基因及其上下游调控序列的表达盒区域 PCR产物电泳检测 同样扩增的片段经过回收后连入准备好的克隆 测序载体中转化感受态大肠杆菌进行克隆并用于测序分析 测序结果与米根霉基因组数据库RhizopusoryzaeDatabase中对应的基因组序列以及pEASY载体上的相对部分序列进行比对 对应的序列同源性分别为98 98 99 100 100 启动子片段电泳及测序检测 载体捕获及启动活性检测 启动子捕获载体构建 构建的启动子探针质粒经过酶切 去磷酸化处理之后回收后 与同样经过酶切回收的启动子片段进行过夜连接并转化大肠埃希氏菌E coliDH5 以氨苄青霉素为抗性标记筛选得到含pUK lpro ppro apro重组质粒的转化子 筛选并鉴定出的转化子经培养之后采用平板划线的方式接种于含不同浓度 80 100 120 150 180 200 g mL 的Amp的固体SOC平板上 观察 内酰胺酶基因在各个启动子片段的启动作用下的表达情况 并由此初步考察这几种启动子片段的启动活性 BACK Note densecolonies comparativelysparsecolonies scatteredcolonies nocolonies 整合载体构建 pBC hygro xr载体构建 以携带潮霉素抗性基因hygroR hph 的pBC hygro载体为骨架构建的插入xr基因融合表达盒的整合型载体 pBS hygro xr载体构建 以噬粒载体pBluescript为骨架构建的携带由米根霉来源的调控元件调控表达的hygroR基因融合表达盒以及xr基因融合表达盒的整合型载体 pBC hygro ldh载体构建 BACK 融合PCR原理 pBC hygro xr载体构建 BACK pBS hygro xr载体构建 BACK 重组质粒转化米根霉及转化子筛选 筛选条件研究 确定米根霉对于潮霉素在一定条件下的敏感性 并依此决定筛选培养基组成 既潮霉素浓度及筛选辅助剂的种类及浓度 转化方法研究 PEG CaCl2介导原生质体转化 LiAc辅助的原生质体电转化 LiAc辅助的萌发孢子电转化 以及基因枪转化法 筛选 转化处理的原生质体或者孢子等经过在无潮霉素的PDA液体培养基中预